蕨类植物氧甲基转移酶的功能研究

论文摘要

蕨类植物作为最早的维管植物,介于低等植物和高等植物之间,而且形态结构多样,常被用来作为研究植物进化和系统发育的重要对象。木质素是植物细胞壁的主组成成分,在植物的生长发育中起到了重要的作用。木质素是由木质素单体聚合而成,木质素单体的生物合成过程中氧甲基化是一步非常重要的反应。植物体内参与木质素单体生物合成的氧甲基转移酶有两种:咖啡酸氧甲基转移酶（Caffeic acid O-methyltransferases,COMTs）和咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（Caffeoyl CoA O-methyltransferases,CCoAOMTs）,都属于S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAM）作为甲基供体的氧甲基转移酶（O-methyltransferases,OMTs）。CCoAOMTs主要在高等植物里被鉴定。目前,在江南卷柏中克隆鉴定了 1个COMT基因,参与木质素生物合成的CCoAOMTs基因的研究在蕨类植物中还未发现。为了研究蕨类植物中Ⅰ型OMTs的进化以及功能,本论文从厚囊蕨,原始薄囊蕨和薄囊蕨中共选取了 51种蕨类植物的转录组数据,从中搜索注释为CCoAOMT的基因。结果显示,在厚囊蕨中没有CCoAOMTs基因的存在,有4个基因属于原始薄囊蕨,37个基因属于薄囊蕨。将这些基因进行系统发育树分析,结果表明,友水龙骨（Polypodiodes amoena）和铁线蕨（Adinatum Capillus-veneris）中各有一个CCoAOMT基因位于原始薄囊蕨基因进化支的根部,各有一个CCoAOMT基因位于薄囊蕨基因进化支的中间部位,于是将这4个基因进行进一步的功能研究。首先将这4个基因分别命名为 PaCCoAOMT1、PaCCoAOMT2、AcCCoAOMT1和AcCCoAOMT2,并将其序列输入到NCBI网站上进行BLAST显示,它们都属于Ⅰ型氧甲基转移酶家族。利用PCR技术分别从各自植物的cDNA中克隆得到完整的ORF,并翻译成相应的氨基酸序列,与苜蓿MsCCoAOMT进行序列比对和进化树分析发现,这4个OMT基因进化上位于高等植物真正的CCoAOMT进化支的根部,与MsCCoAOMT的序列相似性都在60%以上。利用基因重组技术将4个CCoAOMT基因分别构建到原核蛋白表达载体上,经过IPTG诱导表达获得可溶的重组蛋白并进行体外酶活实验,以苜蓿的MsCCoAOMT蛋白活性作为对照。酶活结果显示,4个CCoAOMT基因对黄酮类化合物均具有较高的催化效率,可以特异性的甲基化黄酮B环上的3’位羟基,以及A环上6位羟基,对于B环上含有单个羟基的芹菜素、柚皮素和山奈酚均不具催化特性,具有邻苯二酚结构间位氧甲基化的催化特点。对于苯丙素类化合物,4个CCoAOMT均对咖啡酰-CoA催化活性最高,且转化率与MsCCoAOMT相当。通过烟草下表皮瞬时表达实验对PaCCoAOMTs-GFP融合基因进行了亚细胞定位研究,结果表明PaCCoAOMTs基因都定位在细胞质中。为了进一步研究蕨类植物中CCoAOMTs基因在植物体内的功能,分别将PaCCoAOMT1和PaCCoAOMT2构建入植物表达载体,并转入了模式植物拟南芥中,对转基因植株中木质素和黄酮醇的含量进行测定,并与野生型植株进行比较,发现转基因植物中的木质素含量明显增高,而氧甲基化黄酮醇的含量没有明显的差异。说明PaCCoAOMTs基因在植物体内参与木质素的生物合成,不参与黄酮醇氧甲基化反应。本课题鉴定了 4个参与木质素单体和黄酮氧甲基化的CCoAOMT基因,有助于理解CCoAOMT基因的进化以及木质素的起源与演化。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
•   1 引言
•   2 氧甲基转移酶
•     2.1 定义和分类
•     2.2 氧甲基转移酶的生物学活性
•     2.3 CCoAOMTs的研究进展
•   3 氧甲基转移酶参与修饰的天然产物
•     3.1 木质素单体合成过程中的氧甲基化反应
•     3.2 黄酮类化合物的氧甲基化反应
•   4 立题依据与研究内容
• 第二章 蕨类植物氧甲基转移酶的功能研究
•   1 前言
•   2 实验材料
•     2.1 植物材料
•     2.2 质粒与菌种
•     2.3 主要试剂和试剂盒
•     2.4 实验仪器
•     2.5 主要溶液和培养基
•     2.6 引物序列
•   3 实验方法
•     3.1 CCoAOMT序列分析
•     3.2 蕨类植物RNA提取及cDNA合成
•     3.3 CCoAOMTs目的基因克隆
•     3.4 CCoAOMTs目的基因原核表达载体构建
•     3.5 重组蛋白的体外表达
•     3.6 体外酶活测定
•     3.7 CCoAOMTs定位载体构建和亚细胞定位
•     3.8 CCoAOMTs体内功能分析
•   4 实验结果
•     4.1 CCoAOMTs序列分析
•     4.2 原核表达载体构建
•     4.3 蛋白表达及纯化
•     4.4 体外酶活鉴定
•     4.5 亚细胞定位
•     4.6 目的基因体内功能研究
•   5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 附录1
• 附录2
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张晓双

导师: 程爱霞

关键词: 蕨类植物,木质素,氧甲基转移酶,功能鉴定

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东大学

分类号: Q946.5

总页数: 102

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