利用短链反义RNA技术优化D-甘露糖异构酶表达系统及其应用研究

论文摘要

随着科学研究的逐渐深入,人们发现功能性D-甘露糖在免疫功能调节、癌症预后标志物、肿瘤抑制和尿路感染治疗以及食品添加剂等方面具有广泛的应用前景。而D-甘露糖异构酶可以通过酶催化作用,将果糖异构化为甘露糖。果糖作为原料成本较低且易获得,生物酶法又是一种非常高效、绿色、经济的生产方式,所以对D-甘露糖异构酶的基因工程菌表达的研究极具价值。重组D-甘露糖异构酶基因由乳糖操纵子调控表达,该表达系统为诱导型表达系统,不适用于工业生产,虽然目前工业生产中通常采用乳糖作为诱导剂,但是用量之大仍占生产成本中较大部分,于是课题决定采用反义RNA技术,来阻断乳糖操纵子中阻遏基因lacI的表达,从而解除阻遏作用,去除诱导剂使其成为组成型表达。课题首先针对质粒在大肠杆菌宿主中传代不稳定问题进行了优化,向pET载体中引入parDE“质粒分离致死系统”构建稳定型表达载体,该载体可以在不加抗生素的条件下稳定存在,结果表明稳定表达载体BL21（DE3）/pET-parDE-Fmi在被转接20次后仍保持百分百的质粒稳定性。其次课题设计了针对乳糖操纵子中的lacI基因的反义RNA序列,得到的第一代反义表达载体BL21（DE3）/pET-SRFmi可以在不加诱导剂的条件下表达出酶活为34.5 U/mL的D-甘露糖异构酶,后续通过对反义RNA识别区域、序列长度、转录元件中的启动子以及终止子进行优化,发现识别区域从mRNA起始密码子开始长60 bp,由T7启动子启动转录的反义RNA作用效果最佳,最终酶活为42.3 U/mL。对D-甘露糖异构酶酶学性质的研究,发现D-甘露糖异构酶的最适催化温度为60℃,在30～40℃温度范围内稳定性较好,最适催化pH为7.0,在pH7.0～9.0范围内稳定性较好。D-甘露糖异构酶的米氏常数Km为292.4 mM/L,最大反应速率Vmax为0.139 mM/（L.s-1）。金属离子 Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对 D-甘露糖异构酶的活性均有促进作用,其中K+和Mg2+改善效果最强,酶活分别提高了 47%和45%,而Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+以及Fe2+均使酶活提高了 33%左右,Na+对酶活仅提高了 29%。课题对果糖和甘露糖的分离工艺条件进行了初步探究,结果表明CRS-1Ca型离子交换树脂,上样量为2mL,洗脱流速为1.6mL/min,柱长为2 m时,果糖和甘露糖的分离效果最好,分离度达到0.731,甘露糖的回收率达到95%。基于这些数据设计了处理量为1 kg/h的8柱模拟移动床,最终计算结果得到循环流率为23.96 L/h,萃出液流率（含果糖）为14.63 L/h,残液流率（含甘露糖）为14.28 L/h,每根柱长为1.642 m,柱内径为0.066 m,进出口切换周期△T为12.3 min。

论文目录

• 学位论文数据集
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 甘露糖
•     1.1.1 甘露糖的理化性质
•     1.1.2 D-甘露糖的制备方法
•     1.1.3 D-甘露糖的应用前景
•   1.2 D-甘露糖异构酶简介
•     1.2.1 D-甘露糖异构酶空间结构
•     1.2.2 D-甘露糖异构酶的催化机理
•   1.3 乳糖操纵子
•     1.3.1 乳糖操纵子的基本组成
•     1.3.2 BL21（DE3）诱导表达系统
•   1.4 反义RNA技术
•     1.4.1 反义RNA的分类
•     1.4.2 反义RNA的应用
•   1.5 质粒稳定性
•   1.6 果糖和甘露糖的检测
•     1.6.1 Seliwanoff's Test
•     1.6.2 高效液相色谱法
•   1.7 研究目的及内容
•     1.7.1 研究目的及意义
•     1.7.2 研究框架及内容
• 第二章 稳定型反义表达载体的构建
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 培养基
•     2.1.2 涉及质粒及菌株
•     2.1.3 PCR引物
•     2.1.4 工具酶、仪器及试剂
•   2.2 稳定型表达载体的构建
•     2.2.1 载体构建
•     2.2.2 结果分析
•     2.2.3 传代稳定性实验
•     2.2.4 传代实验结果
•   2.3 反义表达载体的构建
•     2.3.1 载体构建
•     2.3.2 结果分析
•     2.3.3 SDS-PAGE蛋白质电泳检测表达量
•     2.3.4 间苯二酚-盐酸显色法测定D-甘露糖异构酶酶活
•   2.4 反义RNA识别区域的优化
•     2.4.1 载体构建
•     2.4.2 结果分析
•     2.4.3 SDS-PAGE蛋白质电泳检测表达量
•     2.4.4 酶活测定
•   2.5 反义RNA启动子的优化
•     2.5.1 载体构建
•     2.5.2 结果分析
•     2.5.3 SDS-PAGE蛋白质电泳检测表达量
•   2.6 反义RNA终止子的优化
•     2.6.1 载体构建
•     2.6.2 结果分析
•   2.7 阻遏基因lacO的敲除
•     2.7.1 载体构建
•     2.7.2 结果分析
•     2.7.3 SDS-PAGE蛋白质电泳检测表达量
•   2.8 本章小结
• 第三章 酶学性质的测定
•   3.1 实验材料
•   3.2 D-甘露糖异构酶酶学性质的测定
•     3.2.1 D-甘露糖异构酶的分离纯化
•     3.2.2 最适温度
•     3.2.3 最适pH
•     3.2.4 热稳定性研究
•     3.2.5 pH稳定性研究
•     3.2.6 动力学参数的测定
•     3.2.7 金属离子对D-甘露糖异构酶活性的影响
•   3.3 本章小结
• 第四章 果糖/甘露糖分离工艺的初步探究
•   4.1 实验材料
•   4.2 检测方法的确定
•   4.3 离子交换树脂类型
•   4.4 洗脱流速
•   4.5 上样量
•   4.6 柱长
•   4.7 模拟移动床的设计
•   4.8 本章小结
• 第五章 总结与展望
•   5.1 总结讨论
•   5.2 研究成果及创新点
•   5.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李新宇

导师: 王文雅

关键词: 甘露糖异构酶,质粒稳定性,反义,模拟移动床

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京化工大学

分类号: Q55

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.000570

总页数: 96

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