导读:本文包含了枯否细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:细胞,甲酰胺,因子,肝纤维化,损伤,白介素,程序性。
枯否细胞论文文献综述
李明君,董婧,曾涛[1]（2019）在《氧化应激和枯否细胞介导的炎症在二甲基甲酰胺致小鼠急性肝损伤中的作用》一文中研究指出目的:探讨氧化应激和枯否细胞导致的炎症在二甲基甲酰胺(DMF)所致小鼠急性肝损伤中的作用。方法:SPF级ICR雄性小鼠灌胃3g/kgbw的DMF诱导小鼠急性肝损伤,以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC,300mg/kgbw)和NRF-2激动剂萝卜硫素(SF,30mg/kgbw)以及枯否细胞清除剂氯化钆(GdCl3)作为工具药物探讨氧化应激和枯否细胞介导的炎症在DMF肝毒性中的作用;测定血清转氨酶的活性和肝脏病理学变化评价肝损伤的程度;采用生化试剂盒测定肝脏丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的含量;采用ELISA试剂盒测定血清TNF-α的水平;westernblotting技术测定肝(本文来源于《2019全国呼吸毒理与卫生毒理学术研讨会论文集》期刊2019-10-25）
闫德祺,王刚,朱以良,袁紫林,刁波[2]（2019）在《PD-1诱导肝纤维化大鼠枯否细胞M0向M1/M2分化的时相研究》一文中研究指出目的探讨肝纤维化进展过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)蛋白对静态枯否细胞(Kupffer cell,KCs) M0亚群向活化的KCs M1、M2亚群分化的时相。方法随机数字表法将40只SD大鼠分为对照组(16只)和模型组(24只)。模型组以40%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)/60%花生油1.0 ml/kg每周一、周叁皮下注射造模,连续8周;对照组在对应时间皮下注射花生油1.0 ml/kg。于1周、2周、4周、8周后处死大鼠,每次每组4只。①制作大鼠肝脏马松染色(Masson)切片,判断造模情况。②取出大鼠肝脏,分离培养KCs,流式细胞仪分选各期KCs M0、M1、M2期细胞并检测其所占比例。免疫荧光法检测流式细胞仪分离的各期KCs M0、M1、M2各亚群PD-1蛋白的表达。结果①肝纤维化模型制备成功,呈进行性加重趋势;M0亚群比例进行性下降。肝纤维化早期(1～2周)M1亚群比M2亚群高,第四周达到高峰,然后下降;M2亚群早期增加较慢,但持续增加,到后期(8周)时显着高于M1亚群。②免疫荧光结果表明,与对照组比较,M0亚群PD-1蛋白第二周下降(P<0.05),第四周以后显着升高(P<0.05);M1亚群PD-1蛋白进行性下降,M2亚群PD-1蛋白进行性上升。结论在肝纤维化早期,由于M0亚群PD-1蛋白含量较低且表达减少,与M1 PD-1蛋白减少相一致,有利于M0向M1分化。中后期随着M0亚群PD-1蛋白表达升高,与M1亚群PD-1蛋白表达持续降低相反,而与M2亚群PD-1蛋白持续升高一致,导致M0向M1的分化开始下降,向M2分化持续上升。在PD-1蛋白的分化作用调节下,M0亚群有步骤地向着M1和M2方向分化,参与肝的纤维化。(本文来源于《华南国防医学杂志》期刊2019年08期）
庞书杰[3]（2019）在《前折迭素样蛋白通过负性调节枯否细胞功能影响肝脏缺血再灌注损伤及机制研究》一文中研究指出研究背景和目的:肝移植术和肝切除术是治疗良性和早期恶性肝脏疾病的有效手段,但是,肝移植术和行肝门阻断的肝切除术在术后将不可避免的诱发肝脏缺血再灌注损伤,影响患者术后肝脏功能的恢复,甚至会诱发患者围手术期肝功能异常或急性衰竭。因此,研究肝脏缺血再灌注损伤的发生机制及寻找潜在的干预靶点具有实际临床意义。前折迭素样蛋白(Unconventional prefoldin RPB5 interactor,URI),也被称为RNA聚合酶II第五亚基调节蛋白(RNA polymerase II subunit5-mediating protein,RMP)已被证实在糖代谢、调节基因转录,细胞凋亡,促进肿瘤转移等过程中发挥调节功能。近来又有研究发现,URI可以影响核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的激活从而调节Il-6的转录促进肝癌的转移。NF-κB信号通路主要由单核巨噬细胞介导,并是固有免疫反应激活过程中的重要信号通路。基于此,我们前期研究了URI在巨噬细胞系中对于NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信号通路的调节作用,并发现URI可以负性调控此两条通路。由于,肝脏缺血再灌注过程中也涉及到固有免疫反应的活化及肝内库普否细胞(Kupffer cell,KC)介导的NF-κB和MAPKs信号通路的激活。URI能否负性调控KC功能尚不明确,因此本研究将尝试探索URI能否通过调节KC功能影响肝脏缺血再灌注损伤及其中的具体分子机制。方法:首先,收集我院2007-2012年间肝切除治疗的3-5cm肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)患者的临床资料,并比较术中肝门阻断与未阻断患者术后第1,3,5,7天的肝功能指标谷丙转氨酶(Alanine Aminotransferase,ALT),谷草转氨酶(Aspartate Amino Transferase,AST)水平变化。随后,利用先前构建的髓系敲除URI的小鼠模型,分离并鉴定在腹腔巨噬细胞及KC中URI的敲除水平。利用构建成功的髓系敲除(Knock-out,KO)URI的小鼠和野生型(Wild type,WT)小鼠制作70%肝叶缺血1.5h和再灌注6h模型,并设置假手术组对照。收取模型的肝脏、血液标本以进行HE、免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)、Tunel等形态学检测,并结合血清学肝功能指标及血清炎症因子检测评价KO组与WT子小鼠肝损伤差异。接着,蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测收取的冰冻肝组织内NF-κB和MAPKs信号通路,并比较假手术组和实验组中WT和KO小鼠信号通路的激活差异。并用实时PCR(Real-time PCR,RT-PCR)方法检测促炎因子和趋化因子的转录差异。而后,分离WT和KO组的KC,并用RT-PCR法检测敲除URI后对于KC活化后促炎因子和趋化因子转录水平的影响。并且,分离经历肝脏缺血再灌注后的小鼠的KC,比较WT和KO组促炎因子和趋化因子转录水平的差异。再接着,我们研究了在巨噬细胞被短时程、长时程活化后,URI自身的被调节修饰的情况。然后,我们借助NF-κB和MAPKs信号通路中的重要节点分子抑制剂筛选可能与URI潜在相互作用的分子。随后,我们用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法发现URI与IKKβ存在相互结合,并分别构建二者的截短体质粒,研究二者具体相互作用的位置。最后,我们用IP的方法研究了在URI被磷酸化修饰后或磷酸化位点被突变后与IKKβ结合情况的变化。结果:(1)通过比较阻断组与未阻断组肝切除术后第1,3,5,7天的ALT,AST水平,发现阻断肝门发生缺血再灌注损伤的患者术后ALT,AST水平更高,且肝功能恢复延缓;并且阻断时间超过15分钟,术后ALT,AST水平更高;(2)原代腹腔巨噬细胞中URI本底表达也有一定水平,且我们构建的髓系敲除URI的小鼠,URI在腹腔细胞和KC中都得到有效敲除,且效果稳定。(3)相较于假手术对照组,缺血再灌注模型构建成功,且HE检测发现,KO组术后肝损伤明显高于WT组,KO组肝损伤Suzuki评分高于WT组(5.50±1.05 Vs.3.83±0.75,p=0.01);IHC检测I/R后肝组织内浸润的巨噬细胞和中性粒细胞情况,发现KO组两种细胞浸润数明显高于WT组;Tunel检测I/R后肝细胞凋亡情况,发现KO组肝细胞凋亡情况更明显,而假手术组未见明显细胞凋亡。(4)血清学肝功能检测发现,KO组小鼠I/R后ALT,AST水平明显高于WT组,而假手术组未见明显ALT,AST水平升高;Elisa检测发现,KO组小鼠I/R后血清中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)和白介素1β(Intreleukin 1β,IL-1β)水平明显高于WT组,假手术组未见此两种炎症因子水平变化。(5)WB检测发现,KO组小鼠I/R后肝组织内NF-κB和MAPKs信号通路明显较WT组更加活跃,P65,P38和Erk等的磷酸化水平明显更高,而假手术组未见两条信号通路的激活;RT-PCR检测发现,KO组小鼠I/R后肝组织内TNF-α、IL-1β和C-C趋化因子(Chemokine C-C motif,CCL2)转录水平明显高于WT组,而假手术组未见相关促炎因子和趋化因子水平升高。(6)分离肝脏KC,并用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)激活后,RT-PCR检测发现,KO组原代Kupffer细胞活化后TNF-α、IL-1β转录水平明显高于WT组,而BLK处理组未见相关促炎因子转录水平升高;分离经历I/R后的肝脏KC,并用RT-PCR检测发现,KO组原代KC活化后TNF-α、Il-6、IL-1β转录水平明显高于WT组,而假手术组小鼠KC未见转录水平升高。(7)在用LPS激活的巨噬细胞系中,发现NF-κB和MAPKs信号通路激活后,URI被修饰,从15min到2h活化过程中,其带型逐渐上漂;用LPS长时程刺激264.7细胞,发现经历12h以上的激活,URI的转录和表达水平都渐降低且在24h达最低值。(8)结合蛋白磷酸化酶处理、质谱检测及先前文献报道,我们确定URI在巨噬细胞活化后及其介导的NF-κB和MAPKs信号通路激活中,其被磷酸化修饰。用NF-κB和MAPKs信号通路的重要节点分子抑制剂筛选,我们发现,IKKβ的特异性抑制剂,核转录因子抑制蛋白激酶(Inhibitor of nuclear factorκB kinase,IKK)复合物抑制剂和P38的抑制剂可以明显抑制URI在上述过程中的磷酸化修饰,提示URI与IKKβ,IKK复合物和P38具有潜在相互结合。(9)免疫共沉淀检测URI与IKKα,IKKβ,P38及AKT的相互结合情况,并通过正、反拉IP确认URI与IKKβ存在相互结合。(10)构建URI的截短体质粒,免疫共沉淀检测URI结合IKKβ的具体位置,发现IKKβ可以与URI的C端结合;构建IKKβ的截短体质粒,免疫共沉淀法检测IKKβ与URI结合的具体位置,发现IKKβ的激酶结构域可以与URI的C端结合。(11)免疫共沉淀法检测URI在被磷酸化修饰后与IKKβ的结合变化,发现URI在NF-κB通路活化后,其被磷酸化修饰后,其与IKKβ的结合量变少;构建URI磷酸化修饰位点的突变体质粒,再用TNF-α刺激以激活NF-κB来比较野生型URI与突变体URI与IKKβ结合情况,发现突变体URI在此刺激下与IKKβ的结合量高于野生型URI。(12)结合既往研究报道,推测IKKβ-URI-蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase1,PP1)可能会形成复合物,在URI被磷酸化修饰后,URI释放PP1,PP1可以抑制IKKβ的磷酸化,从而对巨噬细胞的活化及其介导的NF-κB和MAPKs信号通路起负性调控作用。结论:髓系敲除URI可以加剧肝脏缺血再灌注损伤。髓系URI水平对于肝脏I/R损伤的调节与其负性调控I/R过程中KC的活化及KC介导的NF-κB和MAPKs信号通路的激活有关。URI与NF-κB和MAPKs信号通路存在着交互调节,在相应通路激活中,URI被磷酸化修饰。URI与IKKβ存在着相互结合,且URI的C端可以结合IKKβ的激酶结构域,并且,在URI被磷酸化修饰后,其与IKKβ结合变弱,这可能与URI可以招募PP1抑制IKKβ磷酸化有关。髓系细胞的URI/IKKβ复合物可能是干预肝脏缺血再灌注损伤的潜在靶点。(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2019-05-23）
刘莹[4]（2019）在《基于PD-1调控肝枯否细胞分化的参杖颗粒阻断肝纤维化机制研究》一文中研究指出目的:探讨肝纤维化进展过程中肝枯否细胞(Kupffer cell,KCs)亚群的分布变化及程序性死亡蛋白-1(Programmed cell death protein 1,PD-1)介导的PI3K-Akt信号通路对KCs亚群分化的调控;体外研究参杖颗粒对KCs分化、KCs表面PD-1表达及其对PI3K-Akt信号通路的调控,以探索参杖颗粒阻断肝纤维化基于PD-1调控KCs分化的机制。前期研究已证实该方抗肝纤维化与肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化调控机制相关,本文在此基础上进一步明确其抗肝纤维化的新靶点,为其抗肝纤维化的作用机制提供新的研究依据。方法:(1)取SD大鼠40只,随机数字表法分为对照组(16只)和模型组(24只)。模型组大鼠腹腔注射40%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL_4)/植物油1.0ml/kg,每周2次,共计8周。对照组在相应时间腹腔注射植物油。分别于1W、2W、4W及8W每组各处死4只。(1)取出肝脏分别行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色及马松(Masson)染色,分析肝脏的病理变化及纤维化进程。以M1亚群抗体CD86和M2亚群抗体CD163进行免疫组化染色鉴别M1和M2细胞,采用ELISA检测KCs中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1的含量,检测不同时期M1和M2两个亚群与纤维化进程的关系。(2)分离培养纤维化不同时期的KCs,墨汁吞噬试验分析其吞噬能力的变化;流式细胞亚群分型检测肝纤维化进展过程中M0、M1和M2所占的比例变化趋势;免疫荧光检测肝纤维化进展过程中KCs PD-1蛋白的表达变化。(2)取SD大鼠10只,随机分为对照组和模型组,每组5只。模型组大鼠腹腔注射40%CCL_4/植物油1.0ml/kg,每周2次,共计8周。对照组腹腔注射等体积的植物油。第8周末处死大鼠,取出肝脏分别行HE及Masson染色,验证肝纤维化模型造模成功。(1)分离培养各组KCs,流式细胞仪法检测KCs M0、M1和M2亚群所占的比例;免疫荧光法检测比较两组PD-1蛋白的表达水平。(2)将两组大鼠KCs分别转染PD-1 Si-RNA,以Western blot法检测转染前后各组KCs PI3k、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的水平。(3)取SD大鼠和PD-1敲除(PD-1-/-)SD大鼠各28只,腹腔注射CCL_4建立大鼠肝纤维化模型,模型组使用参杖颗粒灌胃。随机分为:野生肝纤维化大鼠参杖组(16只),野生肝纤维化大鼠对照组(12只),PD-1-/-肝纤维化大鼠参杖组(16只),PD-1-/-肝纤维化大鼠对照组(12只)。分别于第1周首次灌胃,第2周、第4周、第8周的末次给药后2h处理大鼠。每次每组处理大鼠3只。(1)分离培养各组KCs,流式细胞仪法检测KCs M0、M1和M2亚群所占的比例。(2)测定KCs细胞因子IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα、TGFβ1的含量。(4)取健康雄性Wistar大鼠40只制备含药血清动物,健康SD大鼠和PD-1-/-SD大鼠各12只,建立肝纤维化动物模型。建模后处死分离培养KCs,各随机分为:正常对照组A组、5倍药物浓度组B组、10倍药物浓度组C组、20倍药物浓度组D组共8个组。(1)流式细胞仪检测KCs亚群。(2)荧光定量PCR检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白mRNA的变化。(3)WB检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白及磷酸化的变化。(4)ELISA检测KCs细胞因子谱结果:(1)HE及Masson染色实验说明CCL_4导致了明显的肝损伤和纤维化样病理变化,墨汁染色实验说明KCs吞噬能力逐渐减弱;免疫组化及流式分型结果均显示M1型KCs在肝纤维化早期(1-2W)快速增加,显着高于M2型KCs,第4W达峰后下降;M2型KCs早期增加较慢,到后期(8W)时超过M1型KCs。ELISA显示:M1型分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα呈现先升后降的趋势,在第4W达到最高值。M2型分泌的IL-10和TGFβ1则持续升高。免疫荧光结果表明,模型组KCs PD-1蛋白表达第2W短暂下降后上升,第4W后显着高于对照组(p<0.05)。(2)HE及Masson染色说明肝纤维化造模成功。模型组M1和M2比例增加,明显高于对照组(P<0.05)。免疫荧光结果表明,模型组KCs PD-1蛋白表达显着高于对照组(p<0.05)。Western blot表明模型组PI3k低于对照组(P<0.05),Akt和mTOR表达差异两组无统计学意义(P>0.05),但p-Akt和p-mTOR水平显着下降(P>0.05)。对照组和模型组KCs经培养敲除PD-1基因后,PI3k均显着升高,差异有统计学意义(P<0.05),Akt和mTOR表达没有明显变化(P>0.05),但p-Akt和p-mTOR水平显着升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)流式分型和细胞因子谱结果显示:模型鼠不予治疗情况下,M1及其分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα下降较快,而M2及其分泌的IL-10、TGFβ1缓慢降低;参杖颗粒治疗后M2及其分泌的IL-10、TGFβ1下降,而M1及其分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα上升。PD-1-/-大鼠M1及其分泌的IL-1、IL-2、IL-6、TNFα上升,造模完成后逐渐下降,而M2及其分泌的IL-10、TGFβ1下降较快。(4)(1)PD-1敲除后,纤维化模型大鼠KCs细胞M1亚群比例明显升高,M2亚群比例明显降低。含药血清处理的KCs细胞M1亚群比例均明显升高,其中10倍浓度组与20倍浓度组显着高于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显;M2比例则在含药血清处理后明显降低,其中10倍浓度组与20倍浓度组显着低于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。(2)PD-1敲除后,肝纤维化大鼠模型KCs的PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达水平明显升高。对各组KCs给予含药血清处理后,PD-1 mRNA表达水平被抑制;其中10倍浓度组与20倍浓度组显着低于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。对各组KCs给予含药血清处理后,PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR的mRNA表达水平进一步提高;其中10倍浓度组和20倍浓度组与5倍浓度组具有显着性差异,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。(3)PD-1敲除后,肝纤维化大鼠模型KCs的PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K的表达水平明显升高;Akt、mTOR非磷酸化表达水平没有明显变化,但磷酸化蛋白的水平明显升高。对WT大鼠肝纤维化模型KCs给予含药血清处理后,PD-1蛋白表达水平被抑制;其中10倍浓度组与20倍浓度组显着低于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。对各组KCs给予含药血清处理后,PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K的表达水平明显升高;Akt、mTOR非磷酸化表达水平没有明显变化,但磷酸化蛋白的水平明显升高;且具有正相关的量效关系,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。(4)PD-1敲除后,肝纤维化大鼠模型KCs M1型KCs分泌的细胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNFα的表达水平明显升高;M2型KCs分泌的细胞因子IL-10、TGFβ的表达水平明显降低。对各组KCs给予含药血清处理后,M1型KCs分泌的细胞因子IL-1、IL-2、IL-6、TNFα的表达水平明显升高;且具有正相关的量效关系,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。与之相反,M2型KCs分泌的细胞因子IL-10、TGFβ的表达水平明显降低;且具有负相关的量效关系,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。对含药血清中IL-4和IFNγ含量的检测结果显示,二者均较对照组含量上升,但IL-4升高程度不显着;IFNγ则显著上升,其中10倍浓度组与20倍浓度组IFNγ含量显著高于5倍浓度组,但10倍浓度组与20倍浓度组差异不明显。结论:(1)在肝纤维化早期,M1型KCs比例占优势,对细胞的活化和募集发挥主导作用;而M2型KCs在M1型KCs的活化作用下持续增加,在肝纤维化后期超过M1型KCs,更直接地促进纤维化。KCs早期表达PD-1下降引起M1早期快速上升,参与了KCs亚群的分化和肝的纤维化。(2)KCs PD-1蛋白表达的升高促进KCs的分化,引起肝的纤维化,其机制与PI3K下降,Akt、mTOR磷酸化水平降低,使PI3k/Akt/mTOR信号通路受到抑制有关。抑制PD-1基因表达可以升高Akt和mTOR磷酸化水平,激活PI3k/Akt/mTOR信号通路,抑制KCs的分化,或许可以抑制肝纤维化进程。(3)模型鼠不予治疗情况下,M1由于没有CCL_4刺激,下降较快;由于属于慢性炎症后期,M2缓慢降低;参杖颗粒治疗诱导M2向M1转化。PD-1-/-大鼠M1较多,造模完成后没有CCL_4刺激,也会逐渐下降;不表达PD-1,导致M2转化为M1,因此下降较快。PD-1-/-大鼠迭加参杖颗粒治疗会更快诱导M2向M1转化。(4)参杖颗粒含药血清会抑制PD-1表达,激活PI3K-Akt信号通路;含药血清10倍浓度时效果最佳。(本文来源于《湖北中医药大学》期刊2019-05-16）
苏思标[5]（2019）在《IL-22调控枯否细胞极化抑制肝纤维化的机制研究》一文中研究指出肝纤维化是肝脏慢性炎症损伤时引发持续性损伤修复反应,导致肝组织内细胞外基质异常沉积,进一步引发肝脏结构和肝功能异常改变的一种病理过程。肝纤维化时多种免疫因子的失衡导致和促进了肝纤维化的发生和发展。研究表明,巨噬细胞具有高度的可塑性,在不同的免疫内环境作用下可极化成不同的表型并发挥不同的功能。如脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)及IFN-γ可促进巨噬细胞分化成经典活化的M_1型;M_1型巨噬细胞可产生炎症因子促进机体炎症反应;而IL-4及IL-13可诱导巨噬细胞分化成选择性活化的M_2型,M_2型巨噬细胞可产生抗炎因子如IL-10、TGF-β减轻炎症反应,减少氧化应激、炎症损伤及促进组织修复。枯否细胞(Kupffer cells,KCs)是体内最大的组织巨噬细胞群,是肝脏固有免疫系统的重要功能细胞。临床研究及动物实验已经证实在酒精性及非酒精性脂肪肝病中,M_1型KCs细胞可促进肝细胞的脂肪变性及凋亡,炎性细胞募集,从而导致纤维化,而限制M_1型KCs细胞极化可延缓酒精性肝病的进展。研究发现M_1/M_2型KCs的平衡在酒精或非酒精性肝损伤的发展中起着重要的调控作用。在肝纤维化不同阶段,KCs的M_1和M_2型数量存在动态平衡改变。白介素-22(interleukin-22,IL-22)属于IL-10家族,具有抗炎?促炎的双重作用。在肝脏体内外的研究证实,IL-22具有肝细胞保护作用。我们前期研究发现,IL-22可通过抑制M_1型KCs活性来发挥抗肝纤维化作用,而JAK2/STAT3信号通路在此过程中表达明显升高,提示JAK2/STAT3通路极可能参与IL-22抑制M_1型KCs活性过程。作为调控肝纤维化发生、发展和转归的重要免疫因子,IL-22是否通过调控M_1型KCs活性发挥抗肝纤维化作用,且其中的机制是什么?这在国内外鲜有报道,也正是本研究的兴趣所在。因此,本研究目的在于探讨IL-22在调控M_1/M_2型KCs极化过程中抑制肝纤维化进展的作用,及其与JAK2/STAT3信号通路的关系及机制。第一部分IL-22和KCs与肝纤维化的相关性研究目的:通过收集不同程度肝纤维化患者肝组织标本,检测肝组织纤维化程度,肝组织中IL-22、M_1/M_2型KCs表达水平,分析其与肝纤维化程度的关系;探讨肝组织中IL-22与M_1/M_2型KCs之间的关系。方法:收集不同程度慢性乙型肝炎合并肝纤维化患者的肝组织标本,采用H&E、Masson及天狼猩红(Sirius Red)染色观察肝组织纤维化改变,并根据Ishak评分系统评估肝纤维化的程度及各组变化差异;应用免疫荧光染色检测IL-22在不同肝组织的分布情况;应用免疫荧光双染技术检测M_1型KCs(F4/80~+/iNOS~+)及M_2型KCs(F4/80~+/CD206~+)特征表型,观察不同表型KCs在肝内的数量及分布情况;应用共聚焦显微镜拍摄图片并使用Image J(National Institutes of Health,Bethesda,MD)系统软件分析图像。结果:(1)据于HE、Masson及Sirius Red染色结果,并结合Ishak评分系统,将不同程度肝组织标本分成:正常组(control,n=5),G1S1(n=4),G2S2(n=5),G3S3(n=6)和G4S4(n=6)组,各组按Ishak评分系统评估肝纤维化的程度,各组间Masson染色阳性面积百分比(control:2.8%±0.5%,G1S1:7.8%±0.9%,G2S2:12.7%±0.9%,G3S3:17.9%±2.3%,G4S4:29.8%±5.3%;P<0.01)、Sirius Red染色阳性面积百分比(control:0.58%±0.1%,G1S1:5.4%±1.1%,G2S2:10.5%±1.2%,G3S3:14.8%±1.1%,G4S4:22.2%±3%;P<0.01)结果有显着统计学差异;(2)IL-22荧光染色主要分布于肝血窦及肝小叶中央静脉或汇管区域,其阳性面积百分比在control组(1.7%±0.4%)最低,并在早期肝纤维化时逐渐升高,G2S2(16.3%±1.5%)时表达最高,而在G3S3(9.7%±1.7%)后逐渐减少,G4S4(5.2%±1.3%)时表达明显减少,各纤维化组与control组比较有统计学差异(P=0.000);(3)M_1型KCs(F4/80~+/iNOS~+)及M_2型KCs(F4/80~+/CD206~+)也主要分布于肝血窦及肝小叶中央静脉或汇管区域,其双染阳性面积百分比在control(3.4%±0.5%)肝组织中表达极低,而在G1S1(15.3%±3.4%),G2S2(17.7%±1.3%)中表达逐渐升高,在G3S3(13.4%±1.6%),G4S4(6.5%±1.4%)中逐渐减低,G2S2和G3S3组与control组比较存在统计学显着差异(P=0.000);(4)随着肝纤维化的进展,M_2/M_1比值呈现峰值改变,其中该比值在G2S2(0.62±0.08)期最高,与control组(0.34±0.05)比较具有显着统计学差异(P=0.000)。可见,IL-22,M_1/M_2-KCs主要分布于肝血窦及肝小叶中央静脉或汇管区域,其数量在纤维化早期逐渐增多,但纤维化晚期则逐渐减少;(5)在肝纤维化进展过程中,IL-22的表达与M_1-KCS、M_2-KCs均存在显着正相关(r=0.901,P=0.000;r=0.935,P=0.000)。结论:IL-22,M_1/M_2-KCs主要分布于肝血窦及肝小叶中央静脉或汇管区域,其数量在纤维化早期逐渐增多,纤维化晚期则逐渐减少;在肝纤维化进展过程中,IL-22的表达与M_1/M_2-KCs存在显着的正相关。第二部分体内实验研究IL-22调控KCs极化影响肝纤维化的作用和机制目的:应用小鼠肝纤维化模型阐明IL-22经调控KCs极化影响肝纤维化发生、发展的机制方法:(1)应用BALB/C小鼠腹腔内注射CCl_4构建肝纤维化化模型(将CCl_4溶于食用橄榄油中,配成20%CCl_4溶液备用:按0.4mL/100g剂量,每周注射2次,连用6周),CCl_4给药4w后分别予腹腔注射rmIL-22和anti-IL22,分组为:(1)正常组(normal,n=60);(2)阴性对照组(control,n=40);(3)肝纤维化组(CCl_4,n=40);(4)肝纤维化+IL-22组(CCl_4+rmIL22,rmIL-22,100ng/鼠,5次/周,n=40);(5)肝纤维化+anti-IL22(CCl_4+anti-IL22,anti-IL22,150 ng/鼠,3次/周,n=40);于实验开始的第4、6周分别处死小鼠,取外周血和肝组织,分离肝组织中的KCs;(2)采用H&E、Masson及Sirius Red染色检测肝脏组织纤维化程度,并根据Ishak评分系统评估肝纤维化的程度及各组变化差异;(3)应用免疫荧光双染技术检测M_1型KCs(F4/80~+/iNOS~+)及M_2型KCs(F4/80~+/CD206~+)特征表型,观察不同表型KCs在肝内的数量及分布情况;应用Image J系统软件分析图像;(4)应用ELISA及荧光定量PCR分别检测外周血中相关胶原蛋白、炎症因子和KCs中JAK2/STAT3通路的相关因子表达水平。结果:(1)与normal组相比,CCl_4干预下,4w时小鼠肝纤维化模型建成,8w时已经达到肝硬化。H&E染色下,CCl_4组的肝细胞出现水肿、变性、坏死,可见大量炎性细胞浸润,病变以汇管区明显;对应病变在Masson染色下可见肝内不同程度的深蓝色胶原蛋白沉积,其中,6w CCl_4组(8.58%±1.3%)较4w CCl_4组(5.45%±0.8%)胶原沉积程度明显加重(P<0.01),CCl_4+rmIL-22组(5.2%±0.6%)较6w CCl_4组减轻(P<0.01),而CCl_4+anti-IL22组(10.6%±1.1%)与6w CCl_4组相比,其肝纤维化程度明显加重(P<0.01),提示4-6w时CCl_4诱导小鼠肝纤维化模型构建成功;Sirius Red染色下可见肝内汇管区有不同程度的红绿色胶原(Col-α1、Col-3A1)沉积,其中,6w CCl_4组(9.9%±0.8%)较4w CCl_4组(6.5%±1.1%)肝纤维化程度明显加重(P=0.001)。CCl_4+rmIL-22组(7.8%±1%)肝纤维化程度较6w CCl_4组减轻(P=0.014),而CCl_4+anti-IL22组(12.2%±0.9%)与4w CCl_4组相比,其肝纤维化程度明显加重(P=0.000)。(2)免疫荧光双染检测M_1、M_2-KCs结果显示:各模型组中M_1-KCs细胞数量较control组(1.4%±0.5%)明显增多(P=0.000),其中CCl_4+anti-IL22组(12.4%±0.6%)增多最为显着,而CCl_4+rmIL-22组(6.9%±1.0%)增多较少;与之相反,各模型组(CCl_4+anti-IL22组除外)中M_2-KCs细胞数量较control组(0.8%±0.2%)明显增多(P=0.000),其中以CCl_4+rmIL-22组(9.5%±1.0%)增多最为显着,4w CCl_4组(4.6%±0.8%),6w CCl_4组(4.9%±0.7%)和CCl_4+anti-IL22组(1.8%±0.5%);此外,与control组相比,M_2/M_1比值在CCl_4+rmIL-22组中最高(P=0.000),而CCl_4+anti-IL22组则最低(P=0.031)。(3)外周血ELISA检测结果显示,与control组相比,各模型中IL-1β、IL-6、TGF-β1及Col-α1、Col-3A1表达均呈不同程度升高(P<0.01),其中CCl_4+anti-IL22组升高最为明显,而CCl_4+rmIL-22组升高程度较低。(4)RT-PCR检测KCs相关基因mRNA表达结果显示,来源于CCl_4+rmIL-22组的KCs表达较高水平的STAT3、CD206、IL-22R1、IL-10R2mRNA(P<0.01);各模型组(CCl_4+rmIL-22组除外)中Erk、Akt、IL-1β、IL-6、TGF-β1的表达较control组明显升高(P<0.01);此外,尽管各模型组中JAK2基因表达与control组比较无统计学差异,但各组中iNOS表达较control组均呈不同程度升高(P<0.01)。结论:IL-22在CCl_4诱导肝纤维化小鼠模型中起着抑制肝纤维化的作用,其可能机制是经激活STAT3/IL-10R2信号通路,促进M2-KCs极化,进而抑制KCs促炎因子的分泌,其体内微环境改变,抑制肝纤维化进展。第叁部分体外实验研究IL-22调控KCs极化抑制HSC活性的作用机制目的:观察在体外实验中,IL-22调控KCs极化作用及其信号通路机制,并构建KCs和HSC细胞共培养体系验证IL-22调控KCs极化抑制HSC活性的作用。方法:首先使用人单核细胞系U937进行体外培养,LPS诱导成M_1-KCs巨噬细胞,并予rmIL-22及wp1066(JAK2/STAT3抑制剂)干预后者,分组为:M_0,M_0+DMSO,M_1,M_1+wp1066,M_1+IL-22,M_1+wp1066+IL-22,M_1+anti-IL10R2,M_1+anti-IL10R2+IL-22;采用ELISA,流式细胞仪(FACS),qRT-PCR和Western blotting技术检测KCs中M_1/M_2极化的改变及机制研究;其次,采用胶原酶原位灌注与密度梯度离心分离肝脏原代HSC和KCs,使用F4/80滋株阳性分选、纯化KCs,检测KCs纯度及吞噬活力,将各组(normal,control,CCl_4,CCl_4+rmIL-22,CCl_4+anti-IL22)中分离出的KCs与活化的HSC共培养;应用FACS检测共培养后KCs的M_1/M_2极化比例,免疫荧光检测HSC表达α-SMA;ELISA检测HSC表达Col-α1、Col-3A1情况。结果:(1)U937在200 ng/mL PMA诱导成M_0-KCs,后者在100ng/mL LPS诱导下极化成M_1-KCs,FACS检测M_1-KCs的极化率达76.5%±2.1%,M_0-KCs吞噬自带荧光的乳胶小珠(freelatex beads)活力达94.5%±3.8%;(2)应用不同浓度rmIL-22、wp1066干预M_0-KCs,CCK-8及FACS分别检测细胞增殖率及调亡,结果发现,20ng/mL IL-22及2.5μM wp1066对KCs细胞增殖或调亡均无明显变化;(3)FACS检测不同浓度rmIL-22(10,20,40 ng/mL)对M_1-KCs内p-STAT3活化的程度,结果发现,rmIL-22干预浓度与p-STAT3激活无明显相关,20ng/mL的作用浓度效果最佳,其激活峰值时间在15-30min内,3h后呈明显减弱趋势;(4)ELISA检测提示,IL-1β、IL-6及iNOS在M_1组中表达最高,在加入IL-22干预后发现,叁者表达均显着减低(与M_1相比,P<0.01);而IL-22与wp1066共同干预下,叁者表达呈现不同程度恢复。此外,CD206在M_1中表达较低,随着IL-22和/或wp1066干预后发现,其表达水平均有不同程度增多(与M_1相比,P<0.01)。(5)RT-PCR检测基因表达结果提示,M_1中CD206、IL-22R1及IL-10R2基因在IL-22环境下mRNA表达显着升高,而在wp1066阻断IL-22作用后,除CD206外,其余基因均呈现不同程度减低(与M_1相比,P<0.01);iNOS、IL-1β及IL-6基因在IL-22环境下mRNA表达均显着减低,而在wp1066阻断IL-22作用后,叁者基因mRNA表达水平得到不同程度恢复(P<0.01);(6)FACS检测M_1-KCs在rmIL-22干预后p-STAT3表达情况,其结果显示,rmIL-22干预30min内p-STAT3表达已到峰值,随后随时间的延长逐渐减低,3h后减低显着(P<0.01);其次,在wp1066阻断STAT3通路环境下,rmIL-22对p-STAT3激活的作用被显着抑制(P<0.01);此外,KCs表型极化结果显示,rmIL-22干预30min后,M_1-KCs极化趋势明显减弱,而M_2-KCs则显着增加(P<0.01);有兴趣的是,wp1066能一定程度上抑制M_1-KCs极化(P<0.01);但在wp1066环境下,rmIL-22抑制M_1-KCs极化趋势的作用被减弱,而其促进M_2-KCs极化的作用也被抑制(P<0.01);结果还发现,在anti-IL10R2干预下,rmIL-22对KCs极化的作用完全被阻断,提示IL-10R2可能是IL-22作用KCs的关键作用受体。(7)WB检测结果进一步显示,M_1-KCs在rmIL-22干预30min后,其p-STAT3表达显着增多(P<0.01),而p-JAK2表达不明显;此外,在rmIL-22干预过程中,p-Erk、p-Akt的表达被抑制(P<0.01);其次,wp1066能显着抑制JAK2、p-STAT3的表达(P<0.01);在wp1066干预条件下,rmIL-22激活p-STAT3通路的作用被显着抑制(P<0.01);再次,在使用anti-IL10R2作用KCs后发现,rmIL-22对JAK2、p-STAT3激活作用被阻断(P<0.01);最后,该检测还发现,wp1066及anti-IL10R2对Erk、Akt通路并不产生影响。(8)分离肝脏原代HSC和KCs,使用F4/80~+滋株阳性分选可得到纯度为86.4%±5.3%的KCs,其2h吞噬活性达98.5%±1.3%%;将分离的HSC重悬于含10%血清DMEM培养基中,经贴壁、培养、换液,约5-7d出现明显增殖、活化,予收集、冻存备用;经免疫荧光染色,其α-SMA阳性率为97.5%±2.3%。(9)将各组(normal,control,6w CCl_4,CCl_4+rmIL-22,CCl_4+anti-IL22)中分离出的KCs与活化的HSC共培养24h(分成5组:normal,control,6w CCl_4,CCl_4+rmIL-22,CCl_4+anti-IL22);FACS检测共培养前后KCs的M_2/M_1极化比例结果显示,CCl_4+rmIL-22组M_2/M_1值(22.1%±3.1%)较其他各组显着升高(normal:7.2%±0.9%,control:6.4%±0.7%,6w CCl_4:9.6%±1.5%,and CCl_4+anti-IL22 group:8.9%±1.6%;P=0.000);共培养后各组M_1-KCs极化细胞比例较共培养前明显升高,而M_2-KCs比例减少。(10)免疫荧光检测HSC表达α-SMA结果显示,CCl_4+rmIL-22组(34.9%±4.3%)较其余各组α-SMA表达明显减弱(normal:70.1%±4.6%,control:65.6%±5.9%,6w CCl_4:64.1%±4.7%,and CCl_4+anti-IL22 group:66.5%±6.5%;P<0.01);其余各组间比较无差异。(11)ELISA检测共培养后CCl_4+rmIL-22组HSC分泌的Col-α1、Col-3A1均较其他各组显着减少(P<0.01);而其余各组比较无统计学差异。(12)FACS检测共培养后HSC凋亡结果显示,各组间均未见明显的HSC调亡。结论:体外研究表明,IL-22可通过上调STAT3-IL10R2通路抑制M_1-KCs极化,并下调Erk1/2及Akt通路促进M_2-KCs极化,改变M_1/M_2-KCs的极化平衡,减少促炎症因子的产生。此外,基于体内模型基础上构建体外共培养的实验证实,M_2/M_1-KCs比值升高,可显着抑制HSC的分泌活性。(本文来源于《广西医科大学》期刊2019-05-01）
赵玉莹,杨瑞,管敏杰,曾涛[6]（2018）在《枯否细胞在急性酒精性脂肪肝发病中的作用研究》一文中研究指出目的枯否细胞被证实在酒精性肝病的发病中起着重要作用,但其在酒精性脂肪肝(AFL)发病中的作用仍待阐明。本研究拟探讨枯否细胞及其释放的肿瘤坏死因子α(TNF-α)在AFL发病中的作用。方法 SPF级雄性C57BL/6小鼠40只,随机分为对照组、乙醇组、GdCl_3+乙醇组和益赛普+乙醇组。采用灌胃3次6 g/kg bw乙醇(每两次间隔12 h)诱导急性AFL-。GdCl_3(枯否细胞抑制剂)和益赛普组(TNF-α受体拮抗剂)小鼠分别在每次乙醇暴露前1 h给予10 mg/kg bw的GdCl_3和1 mg/kg bw的益赛普,其余两组小鼠分别给予等体积生理盐水。末次给药6 h后,处死小鼠,测定血清转氨酶活性、肝脏甘油叁酯(TG)含量、以及肝脏和附睾脂肪调控脂肪酸代谢的相关酶的表达。体外实验,以原代附睾脂肪块和HepG2细胞为研究对象,检测TNF-α干预对脂肪动员和HepG2细胞内TG含量的影响。结果与对照组小鼠相比,乙醇组小鼠血清转氨酶活性和TG含量显着增加,肝脏TG、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量显着增多,肝脏重量和肝脏系数显着增加。与乙醇组小鼠相比,GdCl_3干预组和益赛普干预组小鼠肝脏系数和肝脏TG含量降低。油红O染色显示,GdCl_3和益赛普干预组小鼠肝脏冰冻切片中脂肪滴较乙醇模型组减少。与对照组小鼠相比,乙醇组小鼠肝脏甾醇调节原件结合蛋白1c(SREBP-1c)的蛋白和mRNA表达未见明显改变,SREBP-1c调控的脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC蛋白含量显着降低,过氧化物酶体增殖物活化受体α(PPAR-α)及其调控乙酰辅酶A氧化酶(ACOX)的蛋白和mRNA均显着降低。GdCl_3和益赛普对SREBP-1c和PPAR-α通过关键分子的蛋白和mRNA表达并未见明显的影响。与乙醇组相比,GdCl_3和益赛普干预组小鼠附睾脂肪组织调控脂肪动员的激素敏感性脂肪酶(HSL)的磷酸化水平显着降低。体外研究表明,TNF-α可以促进脂肪块分泌游离脂肪酸增加,脂肪块HSL的磷酸化水平增加。TNF-α作用于HepG2细胞并不能导致细胞中明显的脂肪蓄积。结论枯否细胞参与了急性AFL发病,机制主要与其释放的TNF-α导致的外周脂肪动员有关。(本文来源于《2018环境与健康学术会议--精准环境健康：跨学科合作的挑战论文汇编》期刊2018-08-13）
于冰[7]（2018）在《枯否细胞极化调控改善肝纤维化机制的研究》一文中研究指出肝纤维化是对慢性肝病的典型应答,以大量的细胞外基质沉积为病理特征,是肝硬化的早期阶段。当慢性或反复的肝脏炎症刺激因素被去除后,肝纤维化可以逆转。巨噬细胞是肝脏内重要的固有免疫细胞,对维持组织体内平衡和对肝脏损伤做出快速反应具有关键作用。研究发现,枯否细胞对肝星状细胞的功能及基质胶原的分解具有调控作用,能双向调节肝纤维化的形成和逆转。巨噬细胞能随周围微环境改变而迅速极化成不同的表型及功能,是其在肝纤维化过程发挥作用的基础。巨噬细胞功能与其表型密切相关,按目前推荐的巨噬细胞分型命名,M(LPS)型及M(IL-4)型分别对应于之前的M1和M2分型。M(LPS)型巨噬细胞在各种慢性炎症性疾病起着关键的致炎作用。相反,M(IL-4)型巨噬细胞具有抗炎及促修复作用。M(LPS)/M(IL-4)表型失衡是慢性炎症性疾病发病机制的关键环节。那么,通过限制M(LPS)型巨噬细胞的极化,同时/或促进M(IL-4)型巨噬细胞的表达是否可以减轻炎症及促进组织修复?是本文将探讨的问题。白藜芦醇是一种存在于花生、葡萄和浆果等的天然多酚类黄酮,具有多种生物活性。既往研究表明,白藜芦醇对肝损伤和纤维化具有改善的作用。然而,是否白藜芦醇的抗纤维化作用与肝脏巨噬细胞表型转化相关?如果相关,其信号通路如何?目前罕有相关报道。为进一步了解白藜芦醇在抗肝纤维化作用的机制,并阐明巨噬细胞表型转化对肝纤维化的影响,以探索治疗肝纤维化的新靶点,本研究应用CCL_4诱导肝纤维化小鼠模型和RAW264.7巨噬细胞,观察肝脏巨噬细胞极化对肝纤维的影响,并探寻其作用机制。本研究将从以下叁方面进行研究:第一部分白藜芦醇通过促进枯否细胞表型转化改善四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的实验研究目的:构建CCL_4肝纤维化小鼠模型,观察分析小鼠肝纤维化发病过程中M(LPS)型及M(IL-4)型枯否细胞之间的关系,探讨肝纤维化模型肝脏中M(LPS)/M(IL-4)型枯否细胞的极化及平衡对肝纤维化形成的影响及机制。方法:健康雄性BALB/C小鼠18只(6~8周龄),体重20~22克,随机分为:正常对照组(n=6)、CCL_4肝纤维化模型组(n=6)、白藜芦醇干预组(CCL_4+白藜芦醇组)(n=6),干预4周。H&E和Masson染色及Ishak、METAVIR评分系统、羟脯氨酸测定判定肝纤维程度;QRT-PCR检测肝组织M(LPS)型巨噬细胞相关基因:iNOS、TNF-α、MCP1、IL-1β表达,M(IL-4)型巨噬细胞相关基因:Mrc1、Mrc2、Arg1、CD163表达,以及IL-10基因表达;免疫组化法检测肝组织iNOS及CD206标志物;TUNEL与iNOS双染法检测肝组织M(LPS)型枯否细胞凋亡情况。结果:(1)H&E、Masson染色、羟脯氨酸测定、Ishak和METAVIR评分结果提示白藜芦醇可显着改善CCL_4诱导的小鼠肝纤维化;(2)白藜芦醇干预组F4/80基因表达显着增高,提示白藜芦醇促进枯否细胞参与组织修复过程;(3)与CCL_4组比较,白藜芦醇干预组M(IL-4)标志:Arg1、CD163、Mrc1、Mrc2基因表达显着增高(P<0.05),而M(LPS)型标志物iNOS下降(P<0.05),TNF-α及MCP1轻微下降(P>0.05),IL-1β基因表达增高(P<0.05)。免疫组化及免疫荧光染色结果提示,与CCL_4组比较,白藜芦醇干预组M(IL-4)标志物CD206表达显着增高(P<0.05),而M(LPS)标志物iNOS表达显着下降(P<0.05)。以上结果提示:白藜芦醇促进枯否细胞M(LPS)型向M(IL-4)-样表型转化,但仍有M(LPS)型标志物表达。(4)白藜芦醇干预组IL-10基因表达显着高于CCL_4组(P<0.05),提示白藜芦醇促进内源性IL-10基因表达。(5)TUNEL与iNOS免疫组化双染结果提示,白藜芦醇干预组M(LPS)型枯否细胞凋亡率高于CCL_4组(P<0.05),提示白藜芦醇促进M(LPS)型枯否细胞凋亡。结论:白藜芦醇对CCL_4诱导的小鼠肝纤维化改善作用可能是通过促进巨噬细胞内源性IL-10表达及促进M(LPS)型枯否细胞凋亡,使周围微环境向抗炎反应性方向转变,促使M(LPS)型枯否细胞向M(IL-4)-样表型转化,从而促进组织修复。第二部分M2诱导剂调控M(LPS)型巨噬细胞表型转化的体外实验研究目的:通过体外实验验证M2型诱导剂及M2型条件培养基对M(LPS)型巨噬细胞细胞的再极化作用。方法:1.诱导M(LPS)型、M(IL-4)型Raw264.7极化:各组Raw264.7细胞首先在加有10%FBS血清的DMEM培养基中增殖18小时后,再予无血清培养24小时,之后分组如下:(1)对照组:DMEM+不加刺激物;(2)LPS组:DMEM+LPS(1ug/ml);(3)IL-4组:DMEM+IL-4(5ng/ml);(4)白藜芦醇组:DMEM+白芦藜醇(30μM),各组均刺激24小时。QRT-PCR法检测巨噬细胞标志物M(LPS)型标志物:iNOS、TNF-α、MCP1;M(IL-4)标志物Mrc2、Mrc1、Arg1 mRNA表达水平以及IL-10 mRNA水平。共聚焦显微镜免疫荧光双染检测iNOS及CD206表达情况。2.M2型诱导剂及条件培养基对M(LPS)型巨噬细胞的作用:(1)Raw264.7细胞予LPS(1ug/ml)刺激24h,获得M(LPS)型Raw264.7。(2)予M2诱导剂IL-4或白藜芦醇及其条件培养基干预M(LPS)型Raw264.7。i获取M2型条件培养基:从对照组、LPS刺激组、IL-4刺激组、白藜芦醇刺激组收集培养基并离心,去除细胞及细胞碎片成分以获得M1或M2型条件培养基(conditioned medium,CM)。,ii将M(LPS)型Raw264.7分别加入(1)M(LPS)+无血清DNEM;(2)M(LPS)+LPS(1ug/ml);(3)M(LPS)+白藜芦醇(30uM);(4)M(LPS)+IL-4(5ng/ml);(5)M(LPS)+空白培养基CM;(6)M(LPS)+IL-4 CM;(7)M(LPS)+白藜芦醇CM;(8)M(LPS)+LPS CM,分别刺激6h、24h。(3)QRT-PCR检测巨噬细胞标志物M(LPS)型标志物:iNOS、TNF-α、MCP1、IL-1β;M2标志物Mrc1、Mrc2、TGF-β基因表达水平以及IL-10基因表达水平。(4)共聚焦显微镜免疫荧光双染观察CD206、iNOS表达情况。(5)细胞A0-PI双染、HO-PI双染、TUNEL染色检测细胞凋亡情况。结果:(1)经用M(LPS)型诱导剂LPS(1ug/ml)诱导24h后,M(LPS)型标志iNOS呈高表达;经用M(IL-4)型诱导剂IL-4(5ng/ml)、白芦藜醇(30uM)刺激RAW264.7巨噬细胞24h后M(IL-4)标志物Mrc1、Mrc2呈高表达;共聚焦显微镜免疫荧光双染结果:经LPS(1ug/ml)刺激RAW264.7巨噬细胞24h后,M(LPS)型标志物iNOS高表达;经用M2型诱导剂IL-4(5ng/ml)、白芦藜醇(30uM)诱导24h后,M(IL-4)型标志物CD206高表达。提示:LPS能诱导RAW264.7巨噬细胞细胞向M(LPS)分化,而IL-4和白藜芦醇能诱导其向M(IL-4)方向分化。(2)M(LPS)型Raw264.7给予M2型诱导剂及M2型条件培养基共培养6h后,M(LPS)型标志物:iNOS mRNA表达下降,而TNF-αmRNA及MCP1 mRNA表达未见明显抑制,IL-1βmRNA表达增高;M(IL-4)型标志物:Mrc1 mRNA表达增加;IL-10 mRNA在M(LPS)+LPS组、M(LPS)+IL-4组及M(LPS)+Res CM组均增高。共聚焦显微镜免疫荧光双染结果:予M2诱导剂IL-4或白藜芦醇及其条件培养基干预M(LPS)型Raw264.7细胞后iNOS表达下降,而CD206表达增强。提示:M(LPS)型RAW264.7予M2型诱导剂及其CM干预后,M(LPS)型RAW264.7向M(IL-4)-样细胞分化,但仍表达M(LPS)相关标志。(3)细胞A0-PI双染、HO-PI双染、TUNEL染色结果提示:IL-4、白藜芦醇及CM促进M(LPS)型Raw264.7细胞凋亡。结论:与体内实验结果一致,在炎症反应条件下,M2诱导剂IL-4及白藜芦醇可以通过促进巨噬细胞内源性IL-10的表达及促进M(LPS)型巨噬细胞凋亡,使周围微环境从促炎向抗炎反应方向转变,从而诱导M(LPS)型巨噬细胞向M(IL-4)-样表型分化,促进了炎症反应修复过程。第叁部分M2诱导剂通过调控NF-κB1促进巨噬细胞M(LPS)型向M(IL-4)-样转化目的:探寻M2诱导剂促进巨噬细胞M(LPS)型向M(IL-4)-样细胞转化的信号通路。方法:(1)体内实验:健康雄性BALB/C小鼠18只(6~8周龄),体重20~22克,随机分为:正常对照组(n=6)、CCL_4肝纤维化模型组(n=6)、白藜芦醇干预组(CCL_4+白藜芦醇组)(n=6),干预4周。实时荧光定量PCR检测肝组织TLR4、TLR2、MYD88、ERK、C-maf、NF-κB1、NF-κB p65、IL-10、IL-1β、TNF-α基因表达情况。(2)体外实验:Raw264.7细胞予LPS(1ug/ml)刺激24h,获得M(LPS)型Raw264.7。予M2诱导剂IL-4或白藜芦醇及其条件培养基干预M(LPS)型Raw264.7,分组如下:(1)M(LPS)+无血清DNEM;(2)M(LPS)+LPS(1ug/ml);(3)M(LPS)+白藜芦醇(30uM);(4)M(LPS)+IL-4(5ng/ml);(5)M(LPS)+空白培养基CM;(6)M(LPS)+IL-4 CM;(7)M(LPS)+白藜芦醇CM;(8)M(LPS)+LPS CM,分别刺激6h。通过荧光定量RT-PCR检测细胞及肝组织中转录因子TLR4、TLR2、MYD88、ERK、C-maf、NF-κB1、NF-κB(p65)、IL-10、IL-1β、TNF-α基因表达情况。结果:(1)体内实验结果提示:白藜芦醇干预组小鼠肝脏TLR4、TLR2、MYD88、ERK基因表达增高;NF-κB1与IL-10基因表达同步增加;白藜芦醇干预组小鼠肝脏C-maf基因表达与IL-10基因表达显着增加。(2)体外实验结果提示:与体内动物实验结果吻合,M2诱导剂及其条件培养基干预M(LPS)型RAW264.7细胞后,C-maf、NF-κB1、ERK、IL-10mRNA表达增高。结论:(1)炎症反应条件下,白藜芦醇可能通过促进巨噬细胞NF-κB1转录因子的表达,从而增强了对TLRs-MYD88-ERK-IL-10信号通路的调控作用,促进巨噬细胞内源性IL-10的表达,使体内微环境从促炎向抗炎修复反应方向转化,促使M(LPS)型巨噬细胞向M(IL-4)-样细胞极化,从而改善肝纤维化。我们的结果提示,NF-κB1对调控巨噬细胞极化具有重要作用,是抗肝纤维化治疗的潜在作用靶点。(2)白藜芦醇也可能通过促进C-maf基因转录,使内源性IL-10表达增加,促使M(LPS)表型向M(IL-4)-样细胞转化,从而促进炎症修复过程。因此,C-maf可能是调控巨噬细胞极化及抗肝纤维化治疗的另一潜在靶点。(本文来源于《广西医科大学》期刊2018-05-01）
钟欢[8]（2018）在《UII/UT系统介导的急性肝损伤效应与枯否细胞自噬增加和凋亡减少有关》一文中研究指出目的:利用尾加压素II(urotensin II,UII)受体(即UT)特异性拮抗剂urantide阻断UII/UT系统,探讨UII/UT系统对急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)过程中肝组织以及体外LPS刺激大鼠原代枯否细胞(Kupffer cell,KC)自噬水平的影响,以进一步阐明UII/UT系统在ALF过程中的作用机制。方法:体内实验:将健康雄性BALB/c小鼠随机分为A组:正常对照组LPS/DGalN(-)urantide(-);B组:预处理对照组LPS/D-Gal N(-)urantide(+);C组:模型组LPS/D-GalN(+)urantide(-);D组:预处理模型组LPS/D-GalN(+)urantide(+),每组6只(n=6)。其中B和D组给予urantide尾静脉注射预处理,A和C组给予生理盐水对照处理处理。30 min后,C和D组立即LPS/D-GalN腹腔注射诱导急性肝损伤,A和B组给予相同剂量的生理盐水对照处理。腹腔注射6 h后采集小鼠血液和肝组织样本。检测血清谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)水平。采用实时荧光定量PCR(Quantitative Realtime PCR,qRT-PCR)对肝组织Beclin-1、自噬相关基因5(autophagy-related gene,Atg5)、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated proteins 1 light chain 3B,LC3)和p62 mRNA进行相对定量检测,采用蛋白免疫印迹法(western-blot)对自噬相关蛋白LC3和p62进行检测。体外实验:经在体原位灌注、密度梯度离心和早期细胞换液等方法分离纯化SD大鼠原代KC,采用墨汁吞噬法鉴定细胞吞噬功能。将提取的KC随机分成A组:正常对照组LPS(-)urantide(-);B组:预处理对照组LPS(-)urantide(+);C组:模型组LPS(+)urantide(-);D组:预处理模型组LPS(+)urantide(+),每组实验重复6次(n=6)。其中B和D组加入urantide溶液预处理,A和C组给予相同剂量的无菌PBS对照处理。30 min后,C和D组立即加入LPS溶液,A和B组给予相同剂量的无菌PBS对照处理,刺激6 h后收集细胞。采用qRT-PCR检测细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF ReceptorAssociated Factor 6,TRAF6)、LC3和p62 mRNA表达水平,采用Western-Blot检测TRAF6、LC3、p62、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase3)蛋白水平,采用活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测枯否细胞ROS水平。结果:体内实验显示:LPS/D-GalN刺激6 h引起小鼠血清ALT和AST水平升高,C组较A、B组明显升高(均P<0.01);而urantide预处理后,D组较C组显着下降(P<0.01)。此外,C组肝组织Beclin-1、Atg5、LC3和p62 mRNA以及LC3-II、p62蛋白水平较A、B组均明显下降(均P<0.01);D组上述指标较C组而言,均无显着变化,差异均无统计学意义(均P>0.05)。体外实验显示:LPS刺激原代KC 6 h,其炎症信号分子TRAF6和ROS水平明显增高,C组TRAF6 m RNA和蛋白水平以及ROS水平较A、B组均显着上调(均P<0.01);而urantide预处理后,D组上述指标较C组均明显下调(均P<0.01)。此外,C组KC自噬相关指标LC3和p62 mRNA和蛋白水平较A、B组均明显上调(均P<0.01);而urantide预处理后,D组LC3 mRNA和蛋白以及p62 m RNA较C组明显下降,但p62蛋白水平进一步增高(均P<0.01)。同时,C组KC抗凋亡Bcl-2蛋白水平较A、B组均明显下降,促凋亡cleaved caspase3蛋白水平较A、B组明显增高(均P<0.01);而urantide预处理后,D组Bcl-2水平较C组进一步下降,而cleaved caspase3水平较C组进一步增高(均P<0.01)。结论:LPS/D-GalN诱导的ALF模型小鼠肝脏自噬水平明显下降,urantide预处理对ALF肝内自噬水平无影响。LPS能激活KC内炎症信号分子TRAF6,促使ROS产生,诱导KC自噬和凋亡水平的增高;而urantide预处理能抑制LPS引起的KC内TRAF6的增高和ROS的产生,同时抑制KC自噬的增高,促进KC的凋亡。因此,本研究表明UII/UT系统介导的ALF肝损伤效应与肝内抑制的自噬水平无关,但与KC自噬的增强和凋亡的抑制有关。(本文来源于《南京医科大学》期刊2018-05-01）
唐小静,张压西[9]（2017）在《枯否细胞在非酒精性脂肪肝炎中的发病机制》一文中研究指出非酒精性脂肪肝炎(NASH)是一种代谢综合性肝病,是在肝脏细胞脂肪变性基础上进一步诱发炎性反应及纤维化。枯否细胞(KCs)是一种肝巨噬细胞,NASH进展过程中,KCs能够在脂质、内毒素、氧化应激等刺激作用下分泌炎性因子,引发肝细胞炎性反应,损伤肝脏。该文就KCs激活分泌的炎症因子在NASH发病机制中的作用进行详细论述。(本文来源于《安徽医药》期刊2017年09期）
杨瑞,肖默,曾涛[10]（2017）在《化学性肝损伤中枯否细胞极化作用的研究进展》一文中研究指出化学性肝损伤主要是由化学毒物或某些药物引起的肝损伤,发病急,可迅速导致肝衰竭。枯否细胞作为肝脏内的常驻巨噬细胞,可释放促炎或抗炎性细胞因子。枯否细胞具有不同的极化形态:经典促炎的M1型与替代激活的M2型,其极化形态影响着肝损伤的进程。笔者综述了乙醇、对乙酰氨基酚以及四氯化碳诱导的枯否细胞极化在肝损伤中的作用机制及其最新进展,为化学性肝损伤的预防和新药研发提供新思路。(本文来源于《环境与健康杂志》期刊2017年08期）
枯否细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的探讨肝纤维化进展过程中程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)蛋白对静态枯否细胞(Kupffer cell,KCs) M0亚群向活化的KCs M1、M2亚群分化的时相。方法随机数字表法将40只SD大鼠分为对照组(16只)和模型组(24只)。模型组以40%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)/60%花生油1.0 ml/kg每周一、周叁皮下注射造模,连续8周;对照组在对应时间皮下注射花生油1.0 ml/kg。于1周、2周、4周、8周后处死大鼠,每次每组4只。①制作大鼠肝脏马松染色(Masson)切片,判断造模情况。②取出大鼠肝脏,分离培养KCs,流式细胞仪分选各期KCs M0、M1、M2期细胞并检测其所占比例。免疫荧光法检测流式细胞仪分离的各期KCs M0、M1、M2各亚群PD-1蛋白的表达。结果①肝纤维化模型制备成功,呈进行性加重趋势;M0亚群比例进行性下降。肝纤维化早期(1～2周)M1亚群比M2亚群高,第四周达到高峰,然后下降;M2亚群早期增加较慢,但持续增加,到后期(8周)时显着高于M1亚群。②免疫荧光结果表明,与对照组比较,M0亚群PD-1蛋白第二周下降(P<0.05),第四周以后显着升高(P<0.05);M1亚群PD-1蛋白进行性下降,M2亚群PD-1蛋白进行性上升。结论在肝纤维化早期,由于M0亚群PD-1蛋白含量较低且表达减少,与M1 PD-1蛋白减少相一致,有利于M0向M1分化。中后期随着M0亚群PD-1蛋白表达升高,与M1亚群PD-1蛋白表达持续降低相反,而与M2亚群PD-1蛋白持续升高一致,导致M0向M1的分化开始下降,向M2分化持续上升。在PD-1蛋白的分化作用调节下,M0亚群有步骤地向着M1和M2方向分化,参与肝的纤维化。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
枯否细胞论文参考文献
[1].李明君,董婧,曾涛.氧化应激和枯否细胞介导的炎症在二甲基甲酰胺致小鼠急性肝损伤中的作用[C].2019全国呼吸毒理与卫生毒理学术研讨会论文集.2019
[2].闫德祺,王刚,朱以良,袁紫林,刁波.PD-1诱导肝纤维化大鼠枯否细胞M0向M1/M2分化的时相研究[J].华南国防医学杂志.2019
[3].庞书杰.前折迭素样蛋白通过负性调节枯否细胞功能影响肝脏缺血再灌注损伤及机制研究[D].中国人民解放军海军军医大学.2019
[4].刘莹.基于PD-1调控肝枯否细胞分化的参杖颗粒阻断肝纤维化机制研究[D].湖北中医药大学.2019
[5].苏思标.IL-22调控枯否细胞极化抑制肝纤维化的机制研究[D].广西医科大学.2019
[6].赵玉莹,杨瑞,管敏杰,曾涛.枯否细胞在急性酒精性脂肪肝发病中的作用研究[C].2018环境与健康学术会议--精准环境健康：跨学科合作的挑战论文汇编.2018
[7].于冰.枯否细胞极化调控改善肝纤维化机制的研究[D].广西医科大学.2018
[8].钟欢.UII/UT系统介导的急性肝损伤效应与枯否细胞自噬增加和凋亡减少有关[D].南京医科大学.2018
[9].唐小静,张压西.枯否细胞在非酒精性脂肪肝炎中的发病机制[J].安徽医药.2017
[10].杨瑞,肖默,曾涛.化学性肝损伤中枯否细胞极化作用的研究进展[J].环境与健康杂志.2017
论文知识图
