一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用论文和设计-江会锋

全文摘要

本发明提供一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用，通过在野生型氨基酸序列中特定位点引入突变，提高了其与3’‑OH端修饰的核苷酸的耦合效率，实现了高效可控地用于酶促反应合成核酸分子。本发明还提供一种没有模板链的情况下合成核酸分子的方法。

主设计要求

1.一种末端脱氧核糖核苷转移酶(TDT)变体，其特征在于，所述变体的氨基酸序列为仅在对应于SEQIDNO:1第396位置的天冬氨酸被谷氨酸取代，或仅在对应于SEQIDNO:1第403位置的赖氨酸被甲硫氨酸取代。

设计方案

1.一种末端脱氧核糖核苷转移酶(TDT)变体，其特征在于，所述变体的氨基酸序列为仅在对应于SEQ ID NO:1第396位置的天冬氨酸被谷氨酸取代，或仅在对应于SEQ ID NO:1第403位置的赖氨酸被甲硫氨酸取代。

2.如权利要求1所述的变体在提高3’-端修饰的核苷酸聚合效率中的应用，或者在合成核酸分子中的应用。

3.一种在没有模板链的情况下合成核酸分子的方法，所述方法包括在权利要求1所述变体的存在下，使引物链与至少一种核苷酸接触，所述核苷酸为3’-OH端经修饰的核苷酸。

4.根据权利要求3所述的方法，所述变体与3’-OH端经修饰的核苷酸进行耦合。

5.根据权利要求3或4所述的方法，所述3’ -OH端经修饰的核苷酸是所述核苷酸的3’-OH端加入阻断基团进行修饰。

6.根据权利要求5所述的方法，所述阻断基团选自磷酸基团、氨基、叠氮基团、 2-硝基苯基中的至少一种。

7.根据权利要求5所述的方法，所述3’ -OH端经修饰的核苷酸的5’端含有2个或3个磷酸基团。

设计说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用。

背景技术

DNA是生命信息的载体，获得DNA是研究、改造和创造生命的首要步骤。DNA合成技术是生命科学领域最重要的共性基础保障性技术。现有从头合成寡核苷酸的方法主要有两种：化学合成法（固相亚磷酰胺三酯合成法）和生物合成法（酶促合成法）。在20世纪50年代起，化学法和酶促法各有发展，寡核苷酸合成的核心关键变为能可控、高效、持续合成。1981年，固相亚磷酰胺合成法被发明，该方法以多孔玻璃(controlled pore glass, CPG)或聚苯乙烯(polystyrene, PS)作为固相载体，通过脱保护、偶联、加帽和氧化四步循环反应，将带有亚磷酰胺的核苷酸单体逐个加到合成链上，由3'端→5'端延伸合成寡核苷酸，获得不断增长的寡核苷酸链。基于经典固相亚磷酰胺合成法发展出来的合成平台主要有柱式合成和芯片合成两种。到目前为止所有主要合成平台仍采用该合成方法，而这两种平台随着技术的发展都有了长足的进步。但是，化学合成法（固相亚磷酰胺三酯合成法）包括四步循环，反应步骤繁琐、单个循环耗时较长（6-8分钟）、化学试剂消耗较多且成本较高，大量使用有毒、易燃的有机试剂，污染较大。亚磷酰胺四步法中，采用三价磷的亚磷酰胺为合成单体，该价态的三价磷分子结构容易被氧化，也容易与水反应，故为了保证高偶联效率以及低的合成错误率，整个偶联反应过程需要严格的无水无氧环境，即反应过程不仅需要惰性气体保护，而且反应中使用的试剂及清洗溶剂也需要严格控制水份含量，通常试剂中的水份含量需要≤30 ppm，这也不可避免的会增加寡核苷酸合成难度以及合成成本。

由于化学合成法中脱保护步骤需要用到三氯乙酸（TCA）以去除DMT保护基供下一步缩合，当不断延伸的寡核苷酸链重复暴露于此质子酸时，会导致脱氧腺苷和脱氧鸟苷的脱嘌呤残基等副反应的发生，从而导致错误率的升高。除脱嘌呤以外，另一个与酸脱DMT保护基相关的问题是DMT碳正离子的可逆形成。为了完全去除DMT基团，必须将该碳正离子从固相载体表面冲洗掉。否则，由于残余碳正离子引起的脱氧核苷酸5’-羟基的再保护会导致一系列失败序列的产生，其在每个合成循环中会继续延伸。由于以上因素的影响，化学法合成寡核苷酸存在合成长度短，较长链片段错误率高等问题。

因此，如何采用生物酶实现寡核苷酸的可控合成，逐渐成为大家研究的重点。随着DNA测序的发展，过去用于测序的带修饰阻断基团的核苷酸，越来越多的被用于酶促寡核苷酸合成，可实现每次反应只掺入一个核苷酸。近年来，发展了多种方法，采用在不同位点修饰化学基团的核苷酸单体，达到掺入一个核苷酸即终止反应的效果，达到可控的合成寡核苷酸的目的。目前，酶促寡核苷酸的合成主要有两种方法：（1）采用3'-OH端加入阻断基团的核苷酸为底物，酶促反应只能催化一个带修饰基团的核苷酸掺入，随后采用化学或生物方法除去修饰基团，使3'端重新恢复为OH；（2）在核苷酸的其余位点加入阻断基团，同样每次酶促反应只能催化一个带修饰的核苷酸，随后需要去阻断，使催化反应继续。但现有DNA聚合酶活性低，如何实现高效可控酶促寡核苷酸仍是一大难题。

发明内容

本发明提供一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体，可以在不依赖模板的情况下实现高效的催化活性，可显著提高其与3’-OH端经修饰的核苷酸的耦合效率，实现可控的核苷酸链合成。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种末端脱氧核糖核苷转移酶(TDT)变体，包含D396或K403中至少一个位置发生如下突变：D396E或K403M，即与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ IDNO:1第396位置的天冬氨酸被谷氨酸取代，或对应于SEQ ID NO:1第403位置的赖氨酸被甲硫氨酸取代。

在一个实施方案中，所述变体具有和SEQ ID NO：1的序列至少80%的同源性，例如85%、90%、95%、98%的同源性。

在一个实施方案中，所述变体可以在没有模板链的情况下合成核酸分子，例如合成DNA链或者RNA链，包括可用于酶促寡核苷酸的合成，或用于其他循环合成功能DNA和\/或RNA片段、或者用于酶促DNA合成仪的合成DNA\/RNA循环迭代。具体地，所述变体可以高效率的与3’-OH模板被修饰的核苷酸耦合。所述核苷酸的3’-OH端加入阻断基团进行修饰；优选地，所述阻断基团包括但不限于磷酸基团、氨基、叠氮，2-硝基苯基；更优选地，所述阻断基团为磷酸基团。进一步地，所述核苷酸的5’端任选地含有2个磷酸基团或者3个磷酸基团。

第二方面，本发明还提供编码所述变体的核酸序列。所述核酸序列可以是根据编码所述末端脱氧核糖核苷转移酶或其前体的核酸序列得到。

第三方面，本发明还涉及包含所述核酸序列的表达盒、包含所述核酸或者表达盒的载体。进一步地，本发明还提供包含所述核酸序列、表达盒或者所述载体的宿主细胞，例如用所述核酸序列、表达盒或者载体转化或转染原始宿主细胞。

在一个具体实施方案中，所述表达盒包含表达所述变体的所有元件，包括在宿主细胞中转录和翻译过程中所必须的元件，例如，所述表达盒包括启动子和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现所述变体表达的启动子和终止子。例如，启动子可以是原核的或真核的，可选自例如Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子等。本发明所述的表达盒，还可以任选地包括增强子或其他必须元件。

在一个具体实施方案中，所述宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或真核生物。真核生物可以是低等真核生物，诸如酵母(例如，巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母)或真菌(例如属曲霉属(Aspergillus))或高等真核生物诸如昆虫细胞(例如Sf9或Sf21)、哺乳动物细胞或植物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，例如COS(绿猴细胞系) 、CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、小鼠细胞和人类细胞等。

在一个具体实施方案中，所述载体可以是质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒、YAC、BAC、土壤杆菌属(Agrobacterium)pTi质粒等。载体可以优选地包含选自以下的一个或更多个元件：复制起点、多克隆位点和可选择的基因。优选地，载体是质粒。原核载体的一些非详尽实例如下：pQE70、pQE60、pQE–9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A ；ptrc99a、pKK223–3、pKK233–3、pDR540、pBR322、pRIT5、pET-28a。优选地，所述载体是表达载体，优选为pET-28a。

第四方面，本发明还提供所述变体的制备方法，包括培养第三方面的包含所述核酸序列、表达盒或者所述载体的宿主细胞，并任选地在培养液中收集由宿主细胞产生的末端脱氧核糖核苷转移酶变体。

第五方面，本发明还提供所述变体在提高3’-端修饰的核苷酸聚合效率的应用，或者提供所述变体在合成核酸分子中的用途。在一个实施方案中，所述变体在没有模板链的情况下合成核酸分子，例如所述变体可以在没有模板链的情况下合成DNA链或者RNA链。所述变体可以与3’-OH端经修饰的核苷酸进行耦合，合成核酸分子。所述3’ -OH端经修饰的核苷酸可以是所述核苷酸的3’-OH端加入阻断基团进行修饰；优选地，所述阻断基团包括但不限于磷酸基团、氨基、叠氮，2-硝基苯基；更优选地，所述阻断基团为磷酸基团。进一步地，所述核苷酸的5’端任选地含有2个磷酸基团或者3个磷酸基团。所述变体可以提高3’-端经修饰的核苷酸的聚合反应效率。

第六方面，本发明还提出了一种提高3’-OH端经修饰的核苷酸聚合效率的方法，所述方法包括在所述核苷酸的聚合反应中加入本发明所述的变体。本发明进一步提出一种在没有模板链的情况下合成核酸分子的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在本发明所述的变体的存在下，使引物链与至少一种核苷酸接触，所述核苷酸优选3’-OH端经修饰的核苷酸。

有益效果

本发明通过获得了不依赖于模板的末端转移酶（TDT）突变体，这些突变体能显著提高其耦合3’-OH修饰核苷酸的效率，可用于高效可控的合成寡核苷酸，这些TDT突变体可用于酶促寡核苷酸的合成，或用于其他循环合成功能DNA和\/或RNA片段。

附图说明

图1：TDT编码基因序列构建至表达载体pET-28a的质粒图谱。

图2：TDT蛋白表达纯化SDS-PAGE图；从右至左依次是M: marker， 1:沉淀，2:上清，3:流穿，4:50洗，5:200洗。

图3：核苷酸掺入反应全过程示意图：（上）TDT催化反应示意图，包括TDT与3’-OH端修饰的核苷酸的耦合反应；（下）其余酶催化的去磷酸化反应，以便循环。

图4：TDT催化反应；

M1：阴性对照，只是14 bp的寡核苷酸底物；WT：野生型TDT反应后样品；K403M：变体K403M反应后样品；D396E：变体D396E反应后样品；M2：阳性对照，添加1个核苷酸后的15 bp的寡核苷酸链。

图5：TDT野生型及突变体单核苷酸掺入效率结果图。

具体实施方式

定义与说明

本发明中氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala (丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺) ；E：Glu(谷氨酸) ；G：Gly(甘氨酸) ；H：His(组氨酸) ；I：Ile(异亮氨酸) ；L：Leu(亮氨酸) ；K：Lys(赖氨酸) ；M：Met(甲硫氨酸) ；F：Phe(苯丙氨酸) ；P：Pro(脯氨酸) ；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。

本发明中，“同源性”具有本领域常规的含义，是指两个核酸或氨基酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。

本发明当中，所述变体根据它们在特定残基上的突变来描述，其位置通过与野生型酶序列SEQ ID NO:1比对或参考酶序列SEQ ID NO:1来确定。在本发明的上下文中，还涉及在功能等同的残基上携带这些相同突变的任何变体。

在本发明中，术语“引物”和“引物链”可以互换使用，是指初始的核酸片段，通常是与由目标核酸分子全部或部分的引物结合位点互补的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或嵌合序列。引物链可包含天然的、合成的或修饰的核苷酸。引物长度的下限为在核酸扩增反应条件下可以形成稳定双链体所需的最小长度。

在本发明中，术语“突变体”和“变体”可以互换使用，“修饰”或“突变”可以互换施用，这些表达是指相对于野生型蛋白的氨基酸，例如野生型的序列SEQ ID NO:1的鼠(murine)TdT的多肽，或来源于此类多肽的基础上，包含在一个或更多个位置处的改变，即取代、插入和\/或缺失，并仍然保留其活性。变体可以通过本领域已知的各种技术获得。特别地，用于修饰编码野生型蛋白的DNA序列的示例性技术包括但不限于，定向诱变、随机诱变和合成寡核苷酸的构建。

关于氨基酸位置或残基的术语“取代”是指在特定位置处的氨基酸已被其他的氨基酸代替。取代可以是保守的或非保守的。

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位的氨基酸残基”而言，如果在SEQ ID NO: 1所示任一氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第40位就可能是突变体中的第46位。具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是90%以上，优选95%以上，更优选98%的同源性。D396E表示与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ ID NO:1第396位置的天冬氨酸被谷氨酸取代。K403M表示与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ ID NO:1第403位置的赖氨酸被甲硫氨酸取代。

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 TDT蛋白的获得

1．TDT蛋白氨基酸序列

野生型TDT氨基酸序列为SEQ ID NO:1；

2．表达载体的构建

可以合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的所有基因序列均可用于表达载体的构建，将该基因序列构建至表达载体pET-28a（Novagen，Kan+，见图1）酶切位点 Nde<\/i>I和Xho<\/i>I之间，得到重组质粒，命名为pET-28a-TDT。pET-28a为实施例所述，但本发明的表达载体并不仅限于此。

3．基因的表达

为了体外检测TDT酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。实施例中所述的宿主菌为E.coli<\/i>BL21（DE3）。

（1）将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-TDT转入E.coli<\/i> BL21（DE3）中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选（Kan+，100 μg\/mL），37℃过夜培养；

（2）挑单克隆至5 mL LB液体培养基中（Kan+，100 μg\/mL），37℃、220 r\/min培养至OD _{600<\/sub>为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800 mL 2YT培养基中（Kan+，100 μg\/mL），37℃、220rpm培养至OD 600<\/sub>为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5 mM，诱导表达16 h；}

（3）将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500 r\/min 离心15 min；

（4）弃上清，用35 mL蛋白缓冲液（50 mM Tris-HCl，2 mM EDTA，0.1% Triton X-100，pH7.4）将所得菌体沉淀悬起，倒入50 mL离心管中，-80℃冰箱保存。

4 ．蛋白纯化

（1）破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200 bar，4℃条件下对于上述3得到的菌体沉淀破菌2次。4℃、10000 r\/min 离心45 min，取离心后的沉淀、上清，制样；

（2）纯化：上清液经0.45 μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH_{2<\/sub>O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；}

b：上样：将上清按0.5 mL\/min流速缓慢经过Ni 亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50 mL 含50 mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用20 mL含100 mM，200 mM，300 mM 咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12% SDS-PAGE检测，结果如图2所示。

（3）浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50 mL Amicon 超滤管（30 kDa，Millipore公司）离心浓缩（4 ℃、3400 r\/min），浓缩至1 mL。加10 mL蛋白缓冲液，浓缩至1 mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白TDT。

（4）用Nondrop 2000 微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为10 mg\/mL。即得到纯化浓缩的TDT蛋白，其氨基酸序列为：SEQ ID NO：1。

实施例2 突变体的获得

通过计算机模拟，对接底物分子与蛋白质，分析催化机理，获得D396E和K403M变体，采用PCR的方式引入目标变体。变体的表达与纯化与实施例1中野生型TDT表达纯化条件一致。

实施例3 功能验证

本实施例采用的核苷酸是以3'-OH端加入磷酸为阻断基团的核苷酸，所述的5'端为3个磷酸。

1 ．体外纯酶反应，反应示意图参见图3。

2. TDT反应体系：100 mM NaCl，0.25 mM CoCl _{2<\/sub>，50 mM KAc，10 mM Mg(Ac) 2<\/sub>，pH6.8。底物：100 µM oligo（14 bp），1 µM 3’端带修饰基团的核苷酸。酶：0.1 mM TDT野生型及突变体。}

反应条件：35℃保温1 min立即加入0.5 M的EDTA终止反应，并70℃灭活（使得蛋白变性释放oligo链）离心取上清进行尿素变性PAGE胶。

．TDT野生型及变体活性检测：使用16％变性聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)分析。预先倾倒凝胶并静置至聚合。然后将其放置在填充有TBE缓冲液(Sigma)的适当大小的电泳槽上。样品上样到凝胶上。然后使凝胶经历500V至2 000V的电位差持续3至6小时。在迁移令人满意后，释放凝胶，然后转移到孵育盒中。使用磷光屏(phosphor screen) (Amersham)10min至60 min以便可视化，可视化使用预先配置有适当检测模式的Typhoon仪器(GE LifeSciences)进行。经过可视化实验，得到图4的凝胶电泳图，进一步用Tanon的Gel ImageAvestem分析软件分析图片各个DNA条带的亮度，获得亮度值，用掺入核苷酸之后的DNA条带的亮度值（15bp对应DNA条带亮度值）除以总的DNA条带的亮度值（14bp和15bp对应DNA条带的亮度值之和），获得核苷酸掺入效率，结果如图5所示。

根据图5结果可以看出，实施例中两种突变体的单核苷酸掺入效率均优于野生型TDT，呈现更加高的催化效率，可以在没有模板链的情况下高效可控地合成核酸分子。图5显示，变体D396E的单核苷酸掺入效率最佳。如此，不受任何理论束缚，但可以确信变体D396E位于套索状loop区内，该套索结构对于维持酶的活性有很重要的作用。酶可以通过套索loop的空间阻碍效应特异性的结合单链DNA，并通过诱导契合作用结合单核苷酸底物，变体D396E可以增加套索区的结构柔性，增大对3’-OH端修饰核苷酸捕捉效率，并通过延长氨基酸侧链使核苷酸的修饰基团可以与谷氨酸形成氢键，增加亲和力，并最终提高酶活性。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用

<130> CPCN19111017

<141> 2019-08-13

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Pro Leu Gln Ala Val His Leu Gly Pro Arg Lys Lys Arg Pro

1 5 10 15

Arg Gln Leu Gly Thr Pro Val Ala Ser Thr Pro Tyr Asp Ile Arg Phe

20 25 30

Arg Asp Leu Val Leu Phe Ile Leu Glu Lys Lys Met Gly Thr Thr Arg

35 40 45

Arg Ala Phe Leu Met Glu Leu Ala Arg Arg Lys Gly Phe Arg Val Glu

50 55 60

Asn Glu Leu Ser Asp Ser Val Thr His Ile Val Ala Glu Asn Asn Ser

65 70 75 80

Gly Ser Asp Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Gln Asn Ile Lys Ala Ser

85 90 95

Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Ile Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met Gly

100 105 110

Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Met Gly Arg His Gln Leu Val Val Asn

115 120 125

Arg Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala

130 135 140

Pro Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr

145 150 155 160

Leu Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala

165 170 175

Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met

180 185 190

Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met

195 200 205

Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile

210 215 220

Ile Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val

225 230 235 240

Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe

245 250 255

Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg

260 265 270

Thr Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met

275 280 285

Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn

290 295 300

Arg Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val

305 310 315 320

Thr Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg

325 330 335

Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu

340 345 350

Ala Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe

355 360 365

Trp Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr

370 375 380

Phe Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His

385 390 395 400

Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His

405 410 415

Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg

420 425 430

Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu

435 440 445

Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala

450 455 460

Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg

465 470 475 480

Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala

485 490 495

His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

500 505 510

设计图