新化县人民医院湖南娄底417600
【摘要】目的：探讨甲状腺乳头状癌（PTC）中，BRAF基因突变和其CK19、D2-40以及cyclinD1等相关蛋白表达的关系。方法：选取本院2017年7月至2018年7月间接收的PTC以及结节性甲状腺肿伴乳头状增生患者中各40例临床资料作为本次研究对象，通过ARMS法检测各组织的BRAF基因突变情况，同时通过免疫组化SP法对各组织CK19、D2-40以及cyclinD1的蛋白表达水平进行检测分析。结果：PTC组BRAF的基因突变率与CK19、D2-40以及cyclinD1的阳性率相比于乳头状增生组显著更高（P<0.05）；且PTC患者的BRAF基因突变率与cyclinD1的阳性率在有淋巴结转移患者中显著高于无淋巴结转移患者（P<0.05），而D2-40以及CK19蛋白的阳性率在有、无淋巴结转移间的差异未见显著性（P>0.05）。结论：通过对BRAF基因突变、CK19、D2-40以及cyclinD1的联合检测可对甲状腺乳头状癌以及甲状腺的乳头状增生进行诊断，其均可作为甲状腺乳头状癌预测预后的指标，该检测方法值得在临床上进行应用。
【关键词】甲状腺乳头状癌；BRAF基因突变；CK19蛋白；D2-40蛋白；cyclinD1蛋白；相关性
甲状腺癌是在临床上常见的一类内分泌系统的恶性肿瘤疾病，在该病中以甲状腺乳头状癌（PTC）是作为最常见的一类病理类型[1-2]。对于PTC的病理诊断当前主要是依据组织学的特征，然而实际诊断当中对于PTC和甲状腺乳头状增生之间仍较难以进行鉴别[3]。本研究主要以探究甲状腺乳头状癌（PTC）中，BRAF基因突变和其CK19、D2-40以及cyclinD1等相关蛋白表达的关系。
1材料与方法
1.1一般资料
选取本院2017年7月至2018年7月间接收的PTC以及结节性甲状腺肿伴乳头状增生患者中各40例临床资料作为本次研究对象，分别建立PTC组与结节性甲状腺肿伴乳头状增生（对照组）。其中PTC组患者男性16例，女性24例，患者年龄在25~58岁，平均年龄34.1±4.2岁，其中伴颈淋巴结转移者28例，未见转移者12例。对照组中男性17例，女性23例，患者年龄在23~59岁，平均年龄34.4±4.5岁。两组患者的年龄及性别资料的对比上未见有显著性的差异，研究具有可比性。对纳入的所有患者均于术前未行放、化疗治疗以及内分泌治疗等，且收集的样本切片均由病理科科室内的2名经验丰富的医师进行复检并明确进行诊断。所有纳入的对象均签署知情同意书且研究经院伦理委员会的批准展开。
1.2检测方法
（1）免疫组化SP法检测：对研究对象的甲状腺组织均进行常规制片后通过免疫组化SP法对其中的CK19、D2-40以及cyclinD1蛋白进行检测，运用相关蛋白的鼠抗人单克隆抗体、SP型广谱超敏试剂盒（福州迈新生物技术）以及DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术）进行检测操作。（2）ARMS法检测：ARMS法检测各组织的BRAF基因突变情况。其中应用核酸提取试剂盒（北京鑫诺美迪基因检测公司）、V600E突变检测试剂盒（北京鑫诺美迪基因检测公司）。通过聚合酶链反应直接测序法对BRAF以及TERT启动子的突变的情况进行检验，通过4%浓度的甲醛溶液对肿瘤组织进行固定，在经石蜡包埋后切片脱蜡。并取其中1张切片通过常规HE染色后，由病理科医师对肿瘤细胞的含量进行鉴定与评估，取4张切片分别提取出基因组DNA后通过PCR扩增，应用电泳法检测PCR扩增的产物质量，对其中质量相对较高的扩增产物的DNA进行测序，取测序结果与BRAF、TERT基因序列分别展开对比分析发生突变的情况。
1.3观察指标
免疫组化SP法检测中，D2-40阳性标记获取微淋巴管的密度值（MLVD）。CK19阳性以胞质内的棕黄色颗粒评价，而cyclinD1阳性根据细胞着色的强度获取[4-5]。对于ARMS法，则依次确定各反应管的突变Ct（CtM）值以及外控Ct（CtW）值。根据计算情况分为突变型与野生型，计算突变率。
1.4统计学方法
采取SPSS16.0统计学软件包进行数据的统计与分析，基因突变率、蛋白阳性表达占比的组间比较均通过x2检验，当P<0.05代表差异存在有显著性。
2结果
2.1两组患者BRAF突变率对比
在PTC组患者中，BRAF突变率67.5%（27/40）；而在对照组中，则突变率0%（0/40）；两组患者组间差异存在有显著性（P<0.05）。此外，在PTC组中，有淋巴结转移者基因BRAF的突变率89.3%（25/28），无淋巴结转移者的BRAF基因的突变率16.7%（2/12），两者的差异存在有显著性意义（P<0.05）。
2.2两组患者的各相关蛋白的表达情况
CK19、D2-40以及cyclinD1的阳性率中，PTC患者均高于对照组（P<0.05）。见表1。
2.4PTC患者BRAF基因的突变与相关蛋白的表达水平相关性分析
PTC患者的BRAF基因突变率与cyclinD1的阳性率在有淋巴结转移患者中显著高于无淋巴结转移患者（P<0.05），而D2-40以及CK19蛋白的阳性率在有、无淋巴结转移间的差异未见显著性（P>0.05）。见表2。
表1两组患者的各相关蛋白的表达情况[n（%）]
3讨论
在甲状腺的恶性肿瘤当中PTC是最为常见的一个类型[6]。有不少研究显示，PTC的发生、发展与多种驱动因子存在的生物学异常现象见存在有密切的关联性[7-8]。在当前，临床上对于PTC与甲状腺乳头状增生的的诊断上往往较难以进行鉴别，因此，在该病的诊断上寻求新的标记物以提高诊断效率是一项重要的工作。在近年来的不少研究的结果显示，在甲状腺的其他类型恶性肿瘤以及良性病变当中，均检测不出BRAF基因突变的情况，临床上只有PTC可检测出BRAF基因突变现象，因此BRAF基因也是作为PTC的特异性癌基因。有研究提示该基因突变也与PTC的肿瘤复发、病理分期以及淋巴结的转移上存在相关性，因此BRAF基因也被当做PTC预后的一个指标。而有关于甲状腺乳头状癌中BRAF基因的文献报道相对较少，对此，本研究将BRAF基因与几种相关的蛋白表达关系进行比较，研究结果显示，PTC组BRAF的基因突变率与CK19、D2-40以及cyclinD1的阳性率相比于乳头状增生组显著更高（P<0.05）；且PTC患者的BRAF基因突变率与cyclinD1的阳性率在有淋巴结转移患者中显著高于无淋巴结转移患者（P<0.05），而D2-40以及CK19蛋白的阳性率在有、无淋巴结转移间的差异未见显著性（P>0.05）。
因此，通过对BRAF基因突变、CK19、D2-40以及cyclinD1的联合检测可对甲状腺乳头状癌以及甲状腺的乳头状增生进行诊断，其均可作为甲状腺乳头状癌预测预后的指标，该检测方法值得在临床上进行应用。
参考文献：
[1]董丽儒，杨虎，李双，等.甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变及相关蛋白的表达[J].中国癌症杂志，2017，27（4）：251-255.
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[3]卢军峰，解乃昌，马艳红，等.甲状腺乳头状癌组织中BRAF基因突变及CyclinD1蛋白表达的临床意义[J].山东医药，2016（4）：36-37.
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