Keap1-Nrf2-ARE通路与果蝇Kc细胞对溴氰菊酯耐受的关联研究

论文摘要

溴氰菊酯因具有良好的生物活性和环境相容性而被广泛应用于公共卫生、兽医学、尤其是农业领域,使其成为全球广泛使用的拟除虫菊酯之一,导致了全球性的抗药性,而且与其它类型的杀虫剂之间存在广泛的交互抗性。因此,深入研究溴氰菊酯的抗性机理具有非常重要的意义。Keap1-Nrf2-ARE通路是目前已知的最重要的内源性抗氧化应激通路之一。Nrf2转录因子在活性氧刺激下会与构象发生改变的Keap1蛋白解偶联,移位至细胞核内集聚并且与抗氧化反应元件结合,从而激活下游大量抗氧化蛋白与代谢解毒酶。大量研究表明,除活性氧以外,很多外源性有毒物质也会刺激机体内该通路的表达。本课题组的前期实验发现,溴氰菊酯能明显提高果蝇Kc细胞内Nrf2基因的表达水平,并促进Nrf2转录因子向核内移位和集聚。本研究在此基础上,比较了Nrf2和Keap1基因过表达或被干扰情况下细胞对溴氰菊酯的耐受水平的影响,以及Nrf2和Keap1基因表达水平变化对细胞基因表达谱的影响,证实Keap1-Nrf2-ARE通路与溴氰菊酯耐受相关。主要结果如下:1)流式细胞数据分析显示20 ppm的溴氰菊酯处理果蝇Kc细胞24 h能促进细胞凋亡,Nrf2基因过表达,会降低由于溴氰菊酯所造成的细胞凋亡,过表达Keap1基因或干扰Nrf2基因则效果相反。2)转录组测序分析发现,溴氰菊酯胁迫细胞中268个基因的表达水平发生变化,包括细胞色素P450家族基因,谷胱甘肽巯基转移酶家族基因,合成乙酰胆碱酯酶的ace基因,免疫相关基因以及与细胞周期和表皮生成有关的基因,对差异表达基因进行GO分类分析,发现大多基因属于生物过程功能组分中,主要参与生物调节、代谢、解毒、免疫及转运过程。3)在Keap1基因过表达细胞中,溴氰菊酯胁迫引起细胞色素P450家族中的许多基因表达明显下调,且一些与人类疾病相关基因和非编码RNA表达也发生了明显变化。以上结果表明,Keap1-Nrf2-ARE通路与果蝇Kc细胞对溴氰菊酯的耐受存在关联,研究结果为进一步阐明溴氰菊酯抗性的复杂机理提供了新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 昆虫抗性机理的研究进展
•     1.1.1 抗性形成学说
•     1.1.2 抗性机理研究概述
•       1.1.2.1 生理生化抗性
•       1.1.2.1 .1 表皮穿透性的降低
•       1.1.2.1 .2 解毒代谢作用的增强
•       1.1.2.1 .3 敏感度降低
•       1.1.2.2 行为抗性
•     1.1.3 Keap1-Nrf2-ARE通路
•       1.1.3.1 Keap1-Nrf2-ARE通路在昆虫解毒代谢中的作用
•     1.1.4 转录组测序技术的发展与应用
•     1.1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 Nrf2和Keap1 基因表达量变化对果蝇Kc细胞耐受溴氰菊酯应激的影响
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验对象与培养方法
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验耗材与仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 药物处理
•     2.2.3 总RNA的提取与c DNA的合成
•       2.2.3.1 传统TriZol法提取RNA
•     2.2.4 过表达果蝇Kc细胞内Nrf2和Keap1 基因
•       2.2.4.1 PIB/V5-Nrf2 载体的构建及质粒的提取
•       2.2.4.2 PIB/V5-Keap1 载体的构建及质粒的提取
•       2.2.4.3 目的基因质粒转染细胞
•       2.2.4.4 基因水平上转染效率检测
•       2.2.4.5 蛋白水平上转染效率检测
•     2.2.5 干扰果蝇Kc细胞内Nrf2 基因
•       2.2.5.3 基因水平上干扰效率检测
•       2.2.5.4 蛋白水平上干扰效率检测
•     2.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡率
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 转染Nrf2 基因质粒和Keap1 基因质粒后基因表达水平的变化
•     2.3.2 转染Nrf2 基因质粒和Keap1 基因质粒后蛋白表达水平的变化
•     2.3.3 转染Nrf2 基因dsRNA后基因表达水平的变化
•     2.3.4 转染Nrf2 基因dsRNA后蛋白表达水平的变化
•     2.3.5 Nrf2、Keap1 基因表达量的变化与溴氰菊酯应激之间的关系
•   2.4 小结与讨论
• 第3章 RNA-Seq检测溴氰菊酯胁迫下果蝇Kc细胞基因表达谱的变化
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验对象与培养方法
•     3.1.2 实验试剂
•     3.1.3 实验耗材与仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 细胞培养
•     3.2.2 药物处理
•     3.2.3 送测前处理
•     3.2.4 转录组测序
•     3.2.5 荧光定量PCR验证
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 转录组测序筛选所得溴氰菊酯诱导的差异表达基因
•     3.3.2 对差异表达基因进行Gene ontology和 Pathway功能分析
•     3.3.3 荧光定量PCR验证差异表达基因
•   3.4 小结与讨论
• 第4章 Nrf2、Keap1 基因表达量变化对果蝇Kc细胞基因表达谱的影响
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 实验对象与培养方法
•     4.1.2 实验试剂
•     4.1.3 实验耗材与仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 细胞培养
•     4.2.2 细胞转染与药物处理
•     4.2.3 送测前处理
•     4.2.4 转录组测序
•     4.2.5 荧光定量PCR验证
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 转录组测序分析过表达Nrf2的Kc细胞基因表达谱
•     4.3.2 转录组测序分析低表达Nrf2 或过表达Keap1 与溴氰菊酯应激之间的关系
•     4.3.3 荧光定量PCR验证转录组测序准确性
•   4.4 小结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 在读学位期间的研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘雅慧

导师: 程罗根

关键词: 溴氰菊酯,通路,果蝇细胞,差异表达基因

来源: 南京师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 南京师范大学

基金: 国家自然科学基金项目(31460482)

分类号: Q965

DOI: 10.27245/d.cnki.gnjsu.2019.001033

总页数: 65

文件大小: 6531K

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