应用CRISPR/Cas9敲除HeLa细胞DDX21基因对新城疫病毒复制的影响

论文摘要

解旋酶家族是一类对所有生物都至关重要的酶,主要功能是基因解旋,DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶。DEAD-box RNA解旋酶DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。新城疫病毒（NDV）是一种对养禽业危害严重的病原,NDV能够通过多种手段调控宿主先天性免疫,为了探讨DDX21如何调控NDV复制,本研究应用CRISPR/Cas9系统建立DDX21基因敲除的HeLa细胞系,并验证其对NDV复制的影响。针对DDX21基因共设计6条sgRNA,构建敲除载体并电转染细胞,通过药物筛选、亚克隆筛选后,以PCR和Western blot进行敲除效率的双重鉴定,并比较野生型和DDX21敲除细胞中NDV的复制效率。结果显示,由于DDX21对细胞生长至关重要,因此仅获得一株DDX21杂合子敲除细胞,Western blot结果显示DDX21表达量被显著抑制,NDV对在敲除细胞上的复制滴度明显低于野生型细胞,说明DDX21发挥正调控NDV复制的作用,本试验为DDX21调控抗病毒先天性免疫研究奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 质粒、菌株、病毒和细胞
•   1.2 抗体与试剂
•   1.3 sgRNA oligo序列设计及合成
•   1.4 用于DDX21基因敲除的重组质粒构建
•   1.5 电转染靶细胞及单克隆的制备和生长
•   1.6 单克隆细胞系genotyping PCR测序鉴定
•   1.7 Western blot鉴定DDX21敲除
•   1.8 RNA干扰和病毒感染
• 2 结 果
•   2.1 用于DDX21基因敲除打靶载体的构建
•   2.2 DDX21基因敲除细胞株的鉴定
•   2.3 DDX21基因敲除对NDV感染细胞的影响
•   2.4 DDX21干扰对NDV感染细胞的影响
• 3 讨 论
• 4 结 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 武炜,王飒,孟春春,仇旭升,廖瑛,谭磊,宋翠萍,刘炜玮,孙英杰,丁铲

关键词: 新城疫病毒,复制

来源: 畜牧兽医学报 2019年07期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院上海兽医研究所,福建农林大学动物科学学院

基金: 国家自然科学基金面上项目(31872453),国家自然科学基金重点项目(31530074),国家重点研究开发计划(2018YFD0500100)

分类号: S852.65

页码: 1433-1440

总页数: 8

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