拟南芥乙酰乳酸合成酶（AtALS）基因编辑与转基因过表达抗除草剂分析

论文摘要

乙酰乳酸合成酶（acetolactate-synthase,ALS）,又称乙酰羧酸合酶（acetohydroxy acid synthase,AHAS）,是只存在于微生物和植物体内的一种酶,现已有报道ALS基因相关位点进行突变可产生抗除草剂植株。本研究利用在生殖细胞特异启动子ProDD45驱动Cas9表达的植株中转化sgRNA和供体模板的先后转化方法,对拟南芥内源乙酰乳酸合成酶（AtALS）基因进行定点突变替换,为分析不同突变位点对磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的抗性强度和抗性组合情况做出了摸索。同时进行转基因过表达分析位点组合突变对拟南芥除草剂抗性的影响。主要取得以下研究结果:1.体外突变AtALS基因。利用重叠延伸PCR方法,分别单点和组合突变了AtALS基因四个位点（P197S、R199A和W574L、S653F）。利用CRISPR/Cas9技术介导的HDR修复途径,在AtALS基因组选择合适的sgRNA靶位点,构建成单位点或多位点替换载体,载体中同时包含U6启动子驱动的相应的sgRNA和含有碱基定点替换（P197S、R199A和W574L、S653F）的片段以及片段两端的同源臂。2.筛选拟南芥除草剂抗性植株。在ProDD45-Cas9表达植株的基础上转化我们的定点同源替换质粒,筛选抗性标记苗,进一步在T2代筛选除草剂抗性苗。还未得到除草剂抗性植株。3.绿色荧光蛋白融合的多位点突变At ALS基因过表达植物的获得。构建了四个位点（P197S、R199A和W574L、S653F）均发生突变的4mAtALS基因的过表达载体,并与GFP融合表达4mAtALS-GFP,通过农杆菌介导法获得转基因过表达植株。4.荧光体式显微镜观察过表达植株的荧光信号。4mAtALS转基因与GFP融合表达,可以通过荧光体式显微镜观察转基因植株中4mAt ALS-GFP融合蛋白的表达,发现绿色荧光信号均匀分布于拟南芥的叶,茎,根等部位,并且绿色荧光信号在T2代植物群体中有表型分离。这样可以很方便地筛选出高表达4mAtALS-GFP融合蛋白的转基因植株。5.通过Western Blot免疫印迹在蛋白水平检测到4mAtALS-GFP蛋白表达。6.磺酰脲类除草剂抗性实验表明4mAtALS-GFP过表达植株对磺酰脲类除草剂具有抗性。与对照植株相比较,转基因拟南芥在含有浓度5 ppm的苯磺隆除草剂的植株长势明显更好,且对甲氧咪草烟除草剂也有一定的抗性。其中,在喷施除草剂（Trme 25 ppm+Imazamox25 ppm）的实验中,与对照相比4mAtALS–GFP转基因过表达#48号株系植株表现出对苯磺隆除草剂和甲氧咪草烟除草剂的明显耐受性。综上,本研究对CRISPR应用于ALS基因编辑,系统分析除草剂抗性ALS突变位点做出了摸索,我们的突变位点组合转基因结果为改造ALS基因结构和提高转基因植物抗除草剂能力提供了有力依据和基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
•   1.1 基因组编辑技术
•     1.1.1 基因组编辑技术原理
•   1.2 重组核酸酶介导的基因编辑技术
•     1.2.1 锌指核酸酶技术
•     1.2.2 TALENS技术
•     1.2.3 CRISPR-Cas9 系统
•     1.2.4 CRISPR-Cas9 基因编辑技术在作物改良育种中的应用
•   1.3 除草剂研究现状
•     1.3.1 以ALS为靶标的除草剂研究
•   1.4 定点突变
•   1.5 Quick Change定点突变
•   1.6 学位论文选题依据、目标和意义
•   1.7 本实验的技术路线
• 第二章 AtALS基因的克隆
•   2.1 材料
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 方法
•     2.2.1 拟南芥的培养
•     2.2.2 基因组DNA提取及检测
•     2.2.3 AtALS克隆
•     2.2.4 PCR扩增反应体系、反应条件及产物检测
•     2.2.5 目的片段切胶回收
•     2.2.6 Blunt-zero载体的构建
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 基因组DNA浓度与纯度分析
•     2.3.2 AtALS基因的克隆
•   2.4 讨论与小结
• 第三章 体外定点突变
•   3.1 材料
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验试剂
•     3.1.3 常用仪器
•   3.2 方法
•     3.2.1 引物设计
•     3.2.2 PCR扩增
•     3.2.3 目的片段切胶回收
•     3.2.4 突变载体的构建
•     3.2.5 热激法转化感受态细胞
•     3.2.6 Quick Change定点突变
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 PCR扩增效果检测
•     3.3.2 突变片段测序
•   3.4 讨论与小结
• 第四章 U6-sg RNA元件的构建
•   4.1 材料
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验试剂
•     4.1.3 常用仪器
•   4.2 方法
•     4.2.1 sgRNA设计
•     4.2.2 酶切表达载体
•     4.2.3 乙醇沉淀法回收酶切产物
•     4.2.4 单位点载体的构建
•     4.2.5 引物设计,扩增U6+sg RNA片段
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 PCR扩增效果检测
•   4.4 讨论与小结
• 第五章 基因替换供体载体构建
•   5.1 材料
•     5.1.1 菌株和质粒
•     5.1.2 实验试剂
•   5.2 方法
•     5.2.1 引物设计
•     5.2.2 基因替换载体的构建
•     5.2.3 PCR扩增
•     5.2.4 表达载体双酶切
•     5.2.5 质粒DNA小量提取
•     5.2.6 农杆菌介导的对拟南芥的浸染
•     5.2.7 拟南芥遗传转化及基因替换突变体的筛选
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 表达载体双酶切分析
•     5.3.2 U6+sg RNA+m ALS扩增
•   5.4 讨论与小结
• 第六章 4mAt ALS-GFP转基因过表达拟南芥筛选与分析
•   6.1 材料
•     6.1.1 材料与试剂
•     6.1.2 仪器
•   6.2 方法
•     6.2.1 引物设计
•     6.2.2 PCR扩增反应体系、反应条件及产物检测
•     6.2.3 p CAMBIA1300-GFP Sma I,Xba I双酶切
•     6.2.4 过表达载体的构建
•     6.2.5 质粒DNA小量提取
•     6.2.6 农杆菌介导的对拟南芥的浸染
•     6.2.7 拟南芥遗传转化及过表达植株的筛选
•     6.2.8 免疫印迹（Western Blot）
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 拟南芥遗传转化及过表达植株的筛选
•     6.3.2 Leica M205FA荧光体式显微镜观察过表达植株
•     6.3.3 过表达植株蛋白免疫印迹
•     6.3.4 除草剂抗性表型分析
•   6.4 小结与讨论
• 第七章 研究创新点及下一步计划
•   1、研究创新点
•   2、下一步研究计划
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 文素珍

导师: 钟英丽

关键词: 基因定点编辑,磺酰脲类除草剂,咪唑啉酮类除草剂

来源: 湖南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学

单位: 湖南农业大学

分类号: S188

DOI: 10.27136/d.cnki.ghunu.2019.000596

总页数: 77

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