导读:本文包含了杀虫基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:杀虫,基因,杆菌,玉米螟,芽孢,霍尔,活性。
杀虫基因论文文献综述
冯有玲[1]（2019）在《基因工程菌Streptomyces avermitilis TM24次级代谢产物分离鉴定及杀虫杀螨活性研究》一文中研究指出聚酮类化合物是自然界中一类重要的具有生物活性和结构多样性的化合物。该类化合物由酰基辅酶A前体经聚酮合成酶(PKSs)生物合成。利用组合生物合成技术形成杂交PKSs被认为是开发新型聚酮化合物的一种很好的途径。本文对基因工程菌株Streptomyces avermitilis TM24的活性成分进行了初步研究,包括S.avermitilis TM24代谢产物的分离鉴定,以及所得化合物的杀螨和杀虫活性测定。1、基因工程菌株S.avermitilis TM24次级代谢产物的分离与鉴定。将30L基因工程菌株S.avermitilis TM24发酵液过滤、菌体经乙醇萃取、浓缩得到258 g浸膏。浸膏经硅胶柱层析(100-200目)、凝胶柱层析(Sephadex LH-20)、高效液相色谱法(C-18和C-3柱)等分离纯化得到12个化合物。利用核磁共振、高分辨质谱、红外、紫外等波谱分析方法对其进行结构鉴定,鉴定结果表明其中两个分别为天维菌素A和天维菌素B,其余10个为新化合物,命名为Tenvermectin F(1),Tenvermectin G(2),Tenvermectin H(3),Tenvermectin I(4),Tenvermectin K(5),Tenvermectin L(6),Tenvermectin Monosaccharide A(7),Tenvermectin Monosaccharide B(8),Tenvermectin Monosaccharide C(9),Tenvermectin Monosaccharide D(10)。2、化合物杀虫杀螨活性测定。以朱砂叶螨、松材线虫和小菜蛾为供试生物,测定化合物的杀虫和杀螨活性。天维菌素A、天维菌素B、米尔贝A4、化合物1-8对朱砂叶螨的致死中浓LC_(50)为0.0043、0.0049、0.0210、0.0022、0.0172、0.0248、0.0297、0.0723、0.0193、0.0266、0.0776 mg/L,化合物9和10的LC_(50)大于0.2000 mg/L;天维菌素A、天维菌素B、米尔贝A4、化合物1-9对松材线虫24 h的致死中浓LC_(50)分别为3.45、2.17、4.04、28.60、17.11、12.23、19.92、4.56、38.56、4.30、20.19、8.34mg/L,化合物10的LC_(50)大于100 mg/L;化合物1-10对小菜蛾的生物活性较低。3、比较化合物的杀虫杀螨活性和分子结构,天维菌素类化合物C-5、C-13、C-24、C-25位连接不同的基团对杀虫活性影响较大,天维菌素类化合物C-27位呋喃环缺失后杀虫活性降低。论文研究结果为基因工程菌开发提供了一定的理论基础和科学依据。(本文来源于《浙江农林大学》期刊2019-06-06）
单月明[2]（2019）在《苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因的发掘与活性分析》一文中研究指出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)因对多种农业害虫具有特异的杀虫活性,且对非靶标生物安全、环境友好等优点,使其成为世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。其杀虫活性主要源自于菌株本身所产生的杀虫蛋白,这些杀虫蛋白主要由cry基因和vip基因编码,其中cry基因已被应用于转基因作物20余年。因此,发掘Bt杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。目前杀虫基因发掘的主要手段是高通量测序技术,但是由于测序价格较高,且菌株资源库中的重复菌株较多,会造成较大的资金浪费,迫切需要建立大量菌株的比较分析方法,以去除重复菌株,获得用于杀虫基因发掘的菌株。当大量菌株测序完成后,后续通常花费较多时间对菌株的基因组测序数据组装和杀虫基因注释,因此提高杀虫基因发掘效率是十分必要的。现阶段对Bt杀虫基因的发掘仍然具有很大需求,由于某些害虫对现有的Bt杀虫蛋白不够敏感,缺少对某些新靶标害虫具有活性的Bt杀虫蛋白,以及害虫对转基因作物表达的Cry蛋白的抗性问题,因此发掘杀虫活性高且与转基因作物中的Cry蛋白无交互抗性的新型Bt杀虫蛋白非常重要。针对上述需求,本论文围绕Bt菌株分离技术、杀虫基因发掘方法和具有杀虫活性的Bt新基因的筛选鉴定展开研究,主要结果如下:1、Bt菌株的分离技术研究:本研究以基于PCR-RFLP技术的Bt杀虫基因指纹图谱为依据对分离的大量菌株比较分析。首先对菌株基因组提取方法改良,改用磁珠法DNA提取技术可以实现快速高通量提取菌株基因组DNA。然后对引物系统改良,增加引物用于检测更多的杀虫基因。PCR-RFLP图谱分析系统改良,利用基于毛细管电泳系统原理的核酸片段分析仪可以分析比较大量菌株的PCR-RFLP图谱,并且大量菌株的图谱信息可以以数字化的形式输出。进一步结合生物信息学方法计算菌株PCR-RFLP图谱的相似性,最终可以实现对分离的大量菌株中的重复菌株进行去除,获得可用于进一步杀虫基因发掘的菌株。2、Bt菌株混合基因组测序数据中杀虫基因发掘研究:本研究首先模拟了1个Bt菌株混合基因组原始测序数据,然后测试了不同基因组组装软件的组装效果,包括单菌基因组组装软件(IDBA、Velvet)和宏基因组组装软件(IDBA-UD、MetaVelvet),结果显示IDBA-UD软件组装结果最佳,获得的N50及平均序列长度最长。宏基因组基因预测软件MetaGeneMark预测结果显示IDBA-UD组装结果对应预测到的编码基因N50最长。杀虫基因预测结果显示IDBA-UD对应的编码基因库中发掘到的杀虫基因数量最多,达到14个Bt菌株杀虫基因总数的78%。3、具有杀虫活性的Bt新基因筛选:本研究利用二代测序技术分析了78个Bt菌株的基因组,从中获得了大量与已有杀虫基因具有相似性的新基因。对部分(96个)新基因进行杀虫活性筛选,其中包括第一等级的新基因31个,第二等级的新基因48个,第叁等级的新基因16个,第四等级的新基因1个。将这些新基因在大肠杆菌中克隆和表达,结果显示有92个新基因可在大肠杆菌Rosseta(DE3)中表达。最后对表达的蛋白进行杀虫活性分析,结果筛选获得了1个对鳞翅目害虫小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性的新型杀虫基因cry9C-like,而其余91个新基因对几种常见鳞翅目害虫和鞘翅目大猿叶甲未表现出杀虫活性。4、新型Bt杀虫蛋白Cry9Cb1的鉴定:对上面研究中筛选出的cry9C-like新型杀虫基因展开研究,首先将基因序列提交至NCBI GenBank中,获得登录号MK005301,并被Bt毒素命名委员会命名为cry9Cb1。该基因在Bt无晶体突变株HD73~-中可以表达约130 kDa的蛋白,原子力显微镜观察发现该蛋白为球形晶体蛋白。生物活性测定结果表明Cry9Cb1对多种鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性,其中对小菜蛾LC_(50)值为0.38μg/mL,对亚洲玉米螟LC_(50)值为1.28μg/mL,对水稻二化螟LC_(50)值为0.50μg/mL。对小地老虎和东方黏虫表现出中度的杀虫活性,LC_(50)值分别为130.22μg/mL和244.77μg/mL。亚洲玉米螟对Cry9Cb1与Cry1Fa不产生交互抗性。Cry9Cb1对小菜蛾的最小活性区位于72~T~657~V,对亚洲玉米螟的最小活性区位于68~D~655~A。食用安全性评价结果表明:Cry9Cb1与已知过敏蛋白无序列同源性,并且在热处理及模拟胃肠液中快速降解和失活。总而言之,本论文从Bt杀虫基因发掘上展开研究,发掘方法的改良对提高Bt杀虫基因发掘效率具有重要作用;筛选和鉴定高毒力的新型杀虫基因将为Bt杀虫剂的改良和Bt转基因作物的研制奠定良好的基础。(本文来源于《东北农业大学》期刊2019-06-01）
王帆帆,曲绍轩,林金盛,李辉平,侯立娟[3]（2019）在《食用菌异迟眼蕈蚊苏云金芽孢杆菌筛选及杀虫蛋白基因鉴定》一文中研究指出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫谱广,活性高,可以很好地应用于双翅目眼蕈蚊科的防治。为了筛选出对食用菌异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis)有高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株,并进行杀虫蛋白基因鉴定,采用醋酸钠-抗生素法,从江苏省南京市紫金山土壤中分离产晶体芽孢杆菌,通过室内毒力测定和对食用菌菌丝影响试验逐步进行筛选,同时进行Bt杀虫蛋白基因型聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism, PCR-RFLP)扩增鉴定。结果从分离到的17株产晶体芽孢杆菌中筛选出7个对异迟眼蕈蚊杀虫活性的校正死亡率在50%以上且不影响食用菌菌丝生长的菌株。经16S rDNA基因序列同源性分析,这7株菌与公共数据库中苏云金芽孢杆菌菌株的同源性可达99%以上,初步认定为苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)。Bt杀虫蛋白基因型鉴定发现,这7个菌株含有cry4/10、cry11、cyt1、cyt2等4个不同的毒蛋白基因型。筛选出的这7株Bt菌株对于防治食用菌异迟眼蕈蚊具有较好的开发利用潜力。(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2019年02期）
余宗兰,贺利业,孙宏伟,李平,郑爱萍[4]（2019）在《苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性》一文中研究指出为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源,本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因,并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因,全长3501 bp,编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列,与Cry1Db1的同源性最高,为86%,命名为Cry1Dd1(登录号为KJ728844)。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中,转入BT无晶体突变株-HD73中进行表达。结果表明,cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达,并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD,与预测的大小相符。生物活性测定表明,Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性,LC_(50)为13.1μg/mL;能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长;但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析,cry1Dd1包含8个block保守区域,这和目前其他的cry基因相似;Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37～593位氨基酸残基。(本文来源于《中国生物防治学报》期刊2019年02期）
何思琦[5]（2018）在《东方粘虫肌质网钙泵（SERCA）基因在雷公藤次碱杀虫作用中的功能研究》一文中研究指出雷公藤次碱是杀虫植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)的主要活性成分,对小菜蛾(Plutella xylostella)、东方粘虫(Mythimna separata)及菜青虫(Pieris rapae)等多种害虫具有较好的胃毒作用。前期研究表明雷公藤次碱的作用靶标可能存在于昆虫的肌肉系统,且转录组测序结果也表明雷公藤次碱对钙离子相关蛋白的基因表达量有显着影响。鉴于此,本研究基于雷公藤次碱对Ca~(2+)-ATPase活性的影响,利用RNAi技术验证了东方粘虫肌质网钙泵(SERCA)基因在雷公藤次碱杀虫作用中的功能,并采用同源建模和分子对接技术探索了其与肌质网钙泵的结合方式,以期明确肌质网钙泵作为雷公藤次碱分子靶标的可能性,为进一步探讨其杀虫机理奠定基础。主要研究结果如下:1、雷公藤次碱对粘虫幼虫和成虫Ca~(2+)-ATPase活性均具有明显影响。活体条件下,雷公藤次碱(LC_(75)处理)对粘虫幼虫和成虫Ca~(2+)-ATPase活性均表现为激活,36h的酶比活力较对照增加43.34%;离体条件下,雷公藤次碱对幼虫Ca~(2+)-ATPase也具有激活作用,在低浓度下对成虫Ca~(2+)-ATPase具有一定的激活作用,但在高浓度下影响不显着。2、采用RT-PCR及RACE技术克隆获得粘虫SERCA基因,其全长为4139 bp,其中5’端非编码区205 bp,3’端非编码区971 bp,开放阅读框2964 bp,编码987个氨基酸;qRT-PCR检测表明SERCA基因在5龄幼虫和成虫中的表达量较高,且在体壁肌肉组织和消化道中表达量相对较高。3、合成了粘虫SERCA基因的dsRNA片段(dsMsSERCA1、dsMsSERCA2、dsMsSERCA3和dsMsSERCA4),对粘虫幼虫显微注射dsMsSERCA1、dsMsSERCA2、dsMsSERCA3和dsMsSERCA4 48 h后干扰率分别为54.5%、31.2%、61.2%和41.8%;注射dsMsSERCA4后3、4、5 d,试虫体重分别下降52.70%,60.01%和58.02%,且注射了dsMsSERCA的粘虫表现出提前化蛹或是无法正常化蛹的现象。注射dsMsSERCA 24 h后,再分别用LC_(50)剂量的雷公藤次碱处理,48 h后的死亡率分别为32.5%、30.00%、25.00%和43.77%,说明注射dsMsSERCA后试虫对雷公藤次碱的敏感性下降,SERCA与雷公藤次碱的杀虫作用有关。4、同源建模和分子对接技术预测表明雷公藤次碱能紧密地结合至粘虫SERCA氨基酸残基Leu-48、Val-49、Leu-240、Phe-243、Leu-247、Pro-295、Leu-298、Pro-299和Ile-302所组成的疏水性空腔。综合以上结果,粘虫的肌质网钙泵(SERCA)在雷公藤次碱杀虫作用中具有重要的作用。当雷公藤次碱经昆虫取食进入虫体后,可与肌质网上的肌质网钙泵结合,导致细胞内钙稳态失衡,进而影响到肌肉系统的结构与功能,试虫逐步死亡。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-11-01）
闫鸽,宋阳,张宇婷,张卓,代力强[6]（2018）在《Cry1Ab13杀虫基因的PCR诱变及功能验证》一文中研究指出【目的】通过易错PCR技术克隆一种新的Cry1Ab13基因,以利用Cry类Bt基因提高作物抗虫性,丰富基因资源。【方法】利用易错PCR技术对苏云金芽孢杆菌Cry1Ab13基因进行随机诱变,构建突变体文库,筛选获得突变株Cry1Ab13-1,将该基因构建原核重组表达载体后转化到大肠杆菌中进行异源表达,并利用表达的目的蛋白进行抗虫鉴定。【结果】序列分析表明,突变株Cry1Ab13-1基因序列全长2 036bp,与原始碱基序列的一致性为97.79%,有2个碱基发生突变,导致该基因编码的氨基酸序列中有2个氨基酸改变,分别是第130位由脯氨酸变成丝氨酸,第383位由丝氨酸变成苏氨酸;改变后的氨基酸序列与原始氨基酸序列一致性为96.97%。在线分析表明,该基因与已知过敏源的序列同源性低于35%,不存在致敏性。SDS-PAGE电泳分析表明,表达蛋白分子质量大小为79.5ku,与预期结果相符。抗虫鉴定表明,处理72h时表达的目的蛋白对小菜蛾(Plutella xyllostella)幼虫的致死率达87.88%,明显高于未突变基因对照组的幼虫死亡率;对亚洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)幼虫的致死率达81.11%,而且存活的亚洲玉米螟幼虫的生长发育受到明显抑制。【结论】成功克隆了Cry1Ab13-1抗虫基因,且该基因对小菜蛾幼虫和亚洲玉米螟幼虫均具有高效的杀虫活性。(本文来源于《西北农林科技大学学报(自然科学版)》期刊2018年05期）
李阳[7]（2017）在《松树体内菌群对松材线虫侵染响应及Burkholderia pyrrocinia JK-SH007杀虫基因工程菌构建》一文中研究指出松材线虫病具有易传播、发病速度快和死亡率高等特点,素有松树―“艾滋病之称”。而松材线虫侵染早期,进行疫树的施药治疗,其治愈率可极大提高。因此,通过对松材线虫侵染早期,松树体内菌群的结构变化进行研究,可为松材线虫早期侵染诊断提供素材,为松材线虫病早期诊断及防治等亟待突破的关键科学问题提供依据。生防菌剂集安全环保、病虫兼治、植物促生等优点于一身,特别适用于植物病虫害的早期生态防控。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)分泌表达的Cry系列蛋白杀虫活性高,将其相关基因导入具有防病促生宿主菌,实现异源高效表达,是构建具有杀虫功能的生防工程菌的主要手段。本论文采用PCR-DGGE微生物菌群分析、同源重组等分子生物学技术,分析马尾松体内菌群对松材线虫侵染早期阶段的响应规律,研究Cry系列基因在抗病促生菌Burkholderia pyrrocinia JK-SH007中的异源表达活性和杀虫活性,为最终构建松材线虫病早期诊断和生态防控体系奠定基础。取得的主要成果如下:(1)同一林区,不同胸径健康马尾松体内的菌群图谱无显着性差异;接种清水对照组和空白组,马尾松体内菌群图谱无显着差异,表明取样机械损伤、试验期间野外条件变化对马尾松体内菌群均无显着影响;(2)随着松材线虫侵染时间的增加,不同胸径马尾松体内菌种类和丰度均呈整体增加趋势,其中内生菌Mucilaginibacter sp.M68C4A和Uncultured bacteriumclone OTU2265随松材线虫侵染时间增加呈正相关性,内生菌Uncultured bacteriumclone MA13809b03和Klebsiella sp.Arv-22-2.8随松材线虫侵染时间增加呈负相关性;(3)松材线虫侵染处理,不同胸径马尾松体内菌群结构变化具有同步和相似性,表明马尾松体内菌群对松材线虫侵染早期具有一致性响应规律;响应规律分析发现,松材线虫侵染第40d和前30d的体内菌群NMDS结构分离显着,为松材线虫病的早期诊断技术开发奠定理论依据;(4)成功构建B.pyrrocinia JK-SH007遗传操作体系,实现Cry218和Cry3a蛋白在JK-SH007中的异源高效表达,两者表达载体均为pHKT2,但Cry218基因的启动子是PrPL,而Cry3a基因的启动子需换成T7,表明Cry系列基因在同一表达系统中所需启动子有所差异,后续可通过置换不同启动子,实现其它Cry基因在上述表达体系中高效表达;(5)Cry218蛋白表达最佳条件:将工程菌(pHKT2-Cry218)接种入含TP~r(50μg/mL)的LB培养基,30℃,200r/min,待菌液浓度OD600=0.8,升温至42℃,再发酵12 h,在该条件下,蛋白表达浓度达到最大值0.25 g/L;(6)生测结果表明,工程菌B.pyrrocinia JK-SH007(pHKT2-Cry218)及(pHKT2-Cry3a)分别获得对二龄家蚕及榆蓝叶甲幼虫的毒杀活性LC_(50=)0.77(0.57-1.04)g/L及0.63(0.48-0.82)g/L。同时实验分别验证对松材线虫也具毒杀活性,然因对照组宿主菌B.pyrrocinia JK-SH007亦表现一定松材线虫的毒杀活性,故工程菌对松材线虫的毒杀机制有待进一步探讨。(本文来源于《南京林业大学》期刊2017-12-01）
姚萌[8]（2017）在《Bt菌株KN11基因组及杀虫相关基因分析》一文中研究指出苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌,它在生长过程中会形成芽胞和晶体,晶体蛋白具有杀虫作用,因为晶体的杀虫效果好,安全,高效等优点而逐渐成为了广泛使用的微生物杀虫剂。由苏云金芽胞杆菌生产的Bt制剂和转Bt作物对鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)等害虫具有很好的防治效果,在害虫控制方面取得了巨大的成功。目前已知高效商业化菌株KN11对美国白蛾具有很好的杀虫活性,已知该菌株具有cry1Aa、cry1Ac、cry1Ca、cry1Da四种杀虫基因。为明确菌株KN11功能特性,进一步挖掘其杀虫性能潜力,本研究在常规形态观察、SDS-PAGE分析的基础上采用基因组高通量测序技术,对菌株KN11进行了基因组分析,包括基因的注释和预测,全基因组比较,更充分地鉴定杀虫基因,在基因组分析的基础上对杀虫蛋白进行了分析,结果如下:KN11营养生长状态的细胞为长杆状,芽胞为长卵形,晶体数量较多,为双锥形。SDS-PAGE分析结果显示KN11主要杀虫蛋白分子量约为130kD与60kD。切取SDS-PAGE主要蛋白条带,进行胰蛋白酶消化,用LC/MS/MS分析结果显示,主要表达Cry2Ab、Cry1Ac和Cry1Ca叁种蛋白。双端100bp测序基因组显示,高质量序列比例为86.63%。每个测序碱基位置高质量碱基分布显示,随着测序循环数增加,获得高质量碱基数据的比例逐渐下降,read1与read2有相同的趋势,因此为了提高基因组拼接可靠性,不宜用太长的碱基测序read进行拼接。利用基因组拼接软件IDBA-UD对上述高质量reads进行了基因组拼接,结果显示:544个contig长度大于200bp,基因组大小约为6.42M,最大的contig为230.28 Kb,N50长度为52.41 Kb,基因组GC含量为34.76%,与典型的Bt菌株一致。拼接数据显示效果较好。该拼接结果提交到 Genebank,登录号为 NHPK00000000,BioProject ID 为 PRJNA387206,BioSample ID 为 SAMN07141968。将基因组拼接数据利用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline进行基因预测与注释,结果显示该菌株编码6852个基因,其中CDs 6782个,假基因(pseudo genes)346个,tRNAs基因59个,有一个CRISPR Array。对基因注释功能进行GO富集,结果显示这些基因包括细胞过程(biological_process)、细胞组分(cellular_component)以及分子功能(molecular_function)3 部分。将KN11菌株与目前已经完成测序的Bt菌株进行全基因组比较,采用cvTree构建了 KN11与已测序菌株的相似性树(http://tlife.fudan.edu.cn/cvtree/)。结果显示该菌株基因组与已测序Bt菌株有较大差别,与目前广泛使用的鳞翅目害虫高效的Bt库斯塔克亚种菌株HDl并不在一个Cluster中,而其他库斯塔克亚种菌株聚集在同一个Cluster,例如菌株HD1、HD73以及YBT1520,说明KN11和现有广泛使用的库斯塔克亚种菌株有较大差异。将预测的所有蛋白质编码基因对实验室自建的Bt杀虫基因数据库进行BLAST比对,结果显示该菌株编码8个杀虫基因,包括编码cry1Aa1,cry1Ac1,cry1Ca1,cry1Da1,cry1Ia1,cry2Ab1,cry9Ea1以及vip3Aa1等杀虫蛋白基因。用武汉科诺生物科技股份有限公司生产的KN11杀虫剂开展田间药效试验,对菜青虫(Pieris rapae)的调查结果显示,菌株KN11的防治效果与5%卡死克2000倍相比有较好的防治效果;对美国白蛾(Hlyphantria cunea)的防效测试结果表明,采用生物农药4000IU/ml菌株KN11悬浮剂防治美国白蛾效果十分理想,3天后100倍的防效高达96.7%,200倍时达92.6%,400倍时亦高达73.3%。(本文来源于《东北农业大学》期刊2017-12-01）
闫鸽[9]（2017）在《Cry1Ab13杀虫基因的PCR诱变及功能验证》一文中研究指出玉米螟(Ostrinia nubilalis)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella Matsumura)等鳞翅目昆虫对农作物生长发育产生严重的影响,是造成农作物产量降低重要因素之一。利用基因工程技术将抗虫基因转入植物体中,培育具有抗虫性状品种,是解决虫害问题的有效途径之一。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在形成芽孢的同时能产生对鳞翅目、鞘翅目等害虫具有毒性的晶体蛋白,这些蛋白杀虫活性高、专一强,被广泛应用到害虫的综合防治上,但随着推广面积逐步扩大,在其持续选择压力下,害虫对这些活性蛋白产生抗性,导致转入外源基因的植物抗虫能力变弱。因此本研究运用易错PCR技术随机向Cry1Ab13类基因的碱基序列中引入突变,构建突变体文库,并将突变基因构建异源重组表达载体,体外诱导表达,将异源表达的蛋白进行抗虫性验证,从而鉴定诱变后基因杀虫效果,并筛选出杀虫活性更好的抗虫基因,为利用Cry类Bt基因提高作物抗虫性,丰富基因资源。本试验主要获得的结果如下:1.易错PCR诱变及构建突变文库。通过易错PCR技术诱变Cry1Ab13基因,通过筛选获得3个突变子。将突变子与pMD18T Vector相连接并转化到E.coli DH5α中,涂布于LB固体平板上,组成突变体库。通过对测序结果进行比对,突变后基因与Cry1Ab13基因碱基序列一致性分别达97.79%、97.93%、98.32%,与Cry1Ab13基因编码的氨基酸序列一致性分别达96.97%、97.12%、97.68。2.致敏性分析。结果表明3个突变基因与已知过敏原序列同源性均小于35%不存在致敏性。3.构建3个原核重组表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。利用无缝克隆技术成功构建了3个异源重组表达载体分别为pET28a-Cry1Ab13-1、pET28a-Cry1Ab13-2、pET28a-Cry1Ab13-3。把构建好的重组表达载体转化到E.coli BL21中,成功构建工程菌株E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-1)、E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-2)、E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-3)。使用IPTG分别进行诱导表达后SDS-PAGE电泳分析表明,工程菌株E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13-1),和未突变基因对照E.coli BL21(pET28a-Cry1Ab13)在79.5KDa左右分别可以表达出特异的条带,与预期大小相符,表明该菌株得到正确的表达。4.室内杀虫活性的生物鉴定:小菜蛾幼虫室内杀虫活性的生物鉴定结果表明24h、48h、72h实验组小菜蛾幼虫的死亡率分别为18.18%、33.31%、87.88%,要显着高于未突变基因处理组。亚洲玉米螟幼虫室内杀虫活性的生物鉴定结果表明24h、48h、72h实验组幼虫死亡率分别为12.22%、23.89%、81.11%。并且存活玉米螟幼虫生长发育严重受到抑制,72h后实验组单只活虫重量仅为0.18g,是处理前7%,而空载体对照组单只活虫重量为0.252g是处理前98%。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2017-06-01）
李阳,吴酬飞,吴小芹,叶建仁,张立钦[10]（2017）在《Cry3a杀虫蛋白基因的合成优化及在JK-SH007中高效表达》一文中研究指出人工合成优化Cry3a杀虫蛋白基因,并从大肠杆菌BL21(DE3)中克隆T7表达系统,通过同源重组克隆进PHKT2表达载体,将此表达载体导入吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007,通过诱导表达,成功指导合成T7 RNA聚合酶且高效表达分子量为70k Da的Cry3a蛋白。通过粗提液对二龄榆蓝叶甲进行生物毒杀试验,结果表明粗提液具有高毒性,致死中浓度(LC_(50)=0.63(0.48-0.82)g/L)。成功构建的T7表达系统,可高效表达毒性的Cry3Aa蛋白,为进一步开发杀虫生防菌剂,建立外源基因表达技术平台奠定了基础。(本文来源于《中国生物工程杂志》期刊2017年06期）
杀虫基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)因对多种农业害虫具有特异的杀虫活性,且对非靶标生物安全、环境友好等优点,使其成为世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。其杀虫活性主要源自于菌株本身所产生的杀虫蛋白,这些杀虫蛋白主要由cry基因和vip基因编码,其中cry基因已被应用于转基因作物20余年。因此,发掘Bt杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。目前杀虫基因发掘的主要手段是高通量测序技术,但是由于测序价格较高,且菌株资源库中的重复菌株较多,会造成较大的资金浪费,迫切需要建立大量菌株的比较分析方法,以去除重复菌株,获得用于杀虫基因发掘的菌株。当大量菌株测序完成后,后续通常花费较多时间对菌株的基因组测序数据组装和杀虫基因注释,因此提高杀虫基因发掘效率是十分必要的。现阶段对Bt杀虫基因的发掘仍然具有很大需求,由于某些害虫对现有的Bt杀虫蛋白不够敏感,缺少对某些新靶标害虫具有活性的Bt杀虫蛋白,以及害虫对转基因作物表达的Cry蛋白的抗性问题,因此发掘杀虫活性高且与转基因作物中的Cry蛋白无交互抗性的新型Bt杀虫蛋白非常重要。针对上述需求,本论文围绕Bt菌株分离技术、杀虫基因发掘方法和具有杀虫活性的Bt新基因的筛选鉴定展开研究,主要结果如下:1、Bt菌株的分离技术研究:本研究以基于PCR-RFLP技术的Bt杀虫基因指纹图谱为依据对分离的大量菌株比较分析。首先对菌株基因组提取方法改良,改用磁珠法DNA提取技术可以实现快速高通量提取菌株基因组DNA。然后对引物系统改良,增加引物用于检测更多的杀虫基因。PCR-RFLP图谱分析系统改良,利用基于毛细管电泳系统原理的核酸片段分析仪可以分析比较大量菌株的PCR-RFLP图谱,并且大量菌株的图谱信息可以以数字化的形式输出。进一步结合生物信息学方法计算菌株PCR-RFLP图谱的相似性,最终可以实现对分离的大量菌株中的重复菌株进行去除,获得可用于进一步杀虫基因发掘的菌株。2、Bt菌株混合基因组测序数据中杀虫基因发掘研究:本研究首先模拟了1个Bt菌株混合基因组原始测序数据,然后测试了不同基因组组装软件的组装效果,包括单菌基因组组装软件(IDBA、Velvet)和宏基因组组装软件(IDBA-UD、MetaVelvet),结果显示IDBA-UD软件组装结果最佳,获得的N50及平均序列长度最长。宏基因组基因预测软件MetaGeneMark预测结果显示IDBA-UD组装结果对应预测到的编码基因N50最长。杀虫基因预测结果显示IDBA-UD对应的编码基因库中发掘到的杀虫基因数量最多,达到14个Bt菌株杀虫基因总数的78%。3、具有杀虫活性的Bt新基因筛选:本研究利用二代测序技术分析了78个Bt菌株的基因组,从中获得了大量与已有杀虫基因具有相似性的新基因。对部分(96个)新基因进行杀虫活性筛选,其中包括第一等级的新基因31个,第二等级的新基因48个,第叁等级的新基因16个,第四等级的新基因1个。将这些新基因在大肠杆菌中克隆和表达,结果显示有92个新基因可在大肠杆菌Rosseta(DE3)中表达。最后对表达的蛋白进行杀虫活性分析,结果筛选获得了1个对鳞翅目害虫小菜蛾和亚洲玉米螟具有杀虫活性的新型杀虫基因cry9C-like,而其余91个新基因对几种常见鳞翅目害虫和鞘翅目大猿叶甲未表现出杀虫活性。4、新型Bt杀虫蛋白Cry9Cb1的鉴定:对上面研究中筛选出的cry9C-like新型杀虫基因展开研究,首先将基因序列提交至NCBI GenBank中,获得登录号MK005301,并被Bt毒素命名委员会命名为cry9Cb1。该基因在Bt无晶体突变株HD73~-中可以表达约130 kDa的蛋白,原子力显微镜观察发现该蛋白为球形晶体蛋白。生物活性测定结果表明Cry9Cb1对多种鳞翅目害虫具有很高的杀虫活性,其中对小菜蛾LC_(50)值为0.38μg/mL,对亚洲玉米螟LC_(50)值为1.28μg/mL,对水稻二化螟LC_(50)值为0.50μg/mL。对小地老虎和东方黏虫表现出中度的杀虫活性,LC_(50)值分别为130.22μg/mL和244.77μg/mL。亚洲玉米螟对Cry9Cb1与Cry1Fa不产生交互抗性。Cry9Cb1对小菜蛾的最小活性区位于72~T~657~V,对亚洲玉米螟的最小活性区位于68~D~655~A。食用安全性评价结果表明:Cry9Cb1与已知过敏蛋白无序列同源性,并且在热处理及模拟胃肠液中快速降解和失活。总而言之,本论文从Bt杀虫基因发掘上展开研究,发掘方法的改良对提高Bt杀虫基因发掘效率具有重要作用;筛选和鉴定高毒力的新型杀虫基因将为Bt杀虫剂的改良和Bt转基因作物的研制奠定良好的基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
杀虫基因论文参考文献
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