导读:本文包含了小鼠胎儿成纤维细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:小鼠,H2A.X,卵母细胞裂解液,胎儿成纤维细胞(MEFs)
小鼠胎儿成纤维细胞论文文献综述
杨波[1]（2016）在《组蛋白变异体H2A.X在卵母细胞裂解液逆转化小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)成为诱导性多能干细胞(iPSC)中的作用研究》一文中研究指出卵母细胞通过一定的方法裂解后,细胞内能够维持干细胞多能性的一些关键蛋白和信息分子如细胞因子、转录调控因子等被释放出来。小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)经过渗透化处理后,细胞膜的通透性增加,这些因子就可能进入体细胞,促使其发生内源性的染色质结构重建、DNA去甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、维持多能性的必需基因的活化等重编程过程,从而将已分化的体细胞逆转成为诱导性多能干细胞(Induced pleuripotent stem cells,iPSCs)的状态。由于核小体的基本结构是由核心组蛋白八聚体构成的,核小体的紧密程度直接影响了DNA解螺旋及基因的活化,进而影响到了细胞重编程的进行。组蛋白拥有众多变异体,尤其是H2A家族变异体最为丰富,人工替换核小体中的典型组蛋白H2A能够起到调节细胞生理功能的作用。根据以上基因活化原理和核小体组蛋白修饰影响基因表达及活化的研究结果,本研究在运用卵母细胞裂解物诱导已分化体细胞基因组重编程、促使其逆分化为多能干细胞的试验中,通过进一步添加组蛋白变异体H2A.X蛋白、DNA甲基化抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)叁种物质组合,研究被诱导体细胞重编程发生的原理,探索其提高重编程效率、缩短重编程时间和简化重编程试验方法的可能途径。研究试验如下:试验一小鼠卵母细胞裂解液逆转化MEFs为iPSCs的研究本研究通过体外获取小鼠卵母细胞,制备卵母细胞裂解液,利用其中含有的重编程因子,将不同浓度的卵母细胞裂解液(20个/20μl、30个/20μl、40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl)与经过适宜浓度链球菌溶血素O(streptolysin O,SLO)(25U)渗透化处理的第叁代MEFs共孵育,以研究不同浓度的卵母细胞裂解液对MEFs重编程的影响。然后,通过在卵母细胞裂解液重编程中添加单一的表观遗传修饰因子TSA或5-Aza-dC和同时添加TSA、5-Aza-dC两种因子,观察不同处理之间重编程效率的差异,旨在优化卵母细胞裂解液重编程体细胞的体系,提高重编程效率,减少重编程时间。结果表明:当卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl时,iPSCs的集落数(分别为24±1.25个、23.88±0.47个和22±1.63个)极显着高于20个/20μl和30个/20μl处理组的集落数(分别为11.33±1.7个和17±0.82个)(P<0.01),而卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl以及60个/20μl时所形成的ipscs集落数差异不显着(p>0.05);当在卵母细胞裂解液重编程基础上同时添加了tsa和5-aza-dc时,ipscs集落数(35.88±0.77个)显着高于只添加一种表观遗传修饰因子tsa或5-aza-dc的集落数(分别为29±1.45个、30±0.98个)(p<0.05)。因此,在卵母细胞裂解液浓度为40个/20μl、50个/20μl和60个/20μl重编程效率差异不大的情况下,宜采用40个/20μl卵母细胞裂解液重编程mefs,同时,为了提高重编程效率,缩短时间,添加表观遗传修饰因子tsa和5-aza-dc能更大程度的提高卵母细胞裂解液重编程的效率。试验二组蛋白变异体h2a.x蛋白的重组表达及分离纯化本试验通过构建小鼠组蛋白变异体h2a.x重组质粒,利用大肠杆菌系统对重组质粒进行扩增,并对重组质粒进行分离及鉴定,以扩大质粒dna量为转染hek-293t提供大量的h2a.x重组质粒。然后,运用抽提的重组质粒dna转染hek-293t细胞,采用含有效浓度为800ng/ml的新霉素(geneticin,g418)筛选阳性克隆细胞,并对阳性克隆进行增殖培养,以获取大量转染质粒的克隆细胞为后续提取大量变异体h2a.x蛋白提供充足的细胞来源。最后,利用ni-agarosehis标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)对变异体蛋白h2a.x进行分离纯化,并采用sds-page对分离的蛋白质进行纯度分析,旨在分离纯化出大量优质的变异体h2a.x蛋白。结果表明:抽提的重组质粒dna浓度为300ng/μl,电泳结果显示两条带,其中4.7kbp为质粒,440bp为目的基因h2a.x;经过g418筛选15天后稳定转染的阳性克隆细胞贴壁率达90%以上;经分离纯化的变异体h2a.x蛋白的浓度为38.96μg/ml,sds-page电泳结果显示蛋白样品纯度高,大小为16.7kd。试验叁不同分化阶段小鼠细胞变异体h2a.x蛋白含量的测定本试验利用酶联免疫技术(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)对不同分化阶段的细胞,包括小鼠卵母细胞、mefs、受精卵、2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎、8-细胞期胚胎、桑椹胚、囊胚胚胎干细胞(embryonicstemcells,escs)和ipscs进行组蛋白变异体含量的测定,旨在探究出不同分化阶段细胞的变异体含量变化趋势。结果表明:不同阶段的细胞变异体蛋白的含量分别为mefs(40个/20μl)为15.8±0.93ng,卵母细胞裂解液(40个/20μl)为57±1.64ng,受精卵(40个/20μl)为87.2±1.45ng,2-细胞期胚胎(20个/20μl)为73.13±1.24ng,4-细胞期胚胎(10个/20μl)为66.2±1.76ng,8-细胞期胚胎(5个/20μl)为60.5±2.12ng,桑椹胚内的细胞(40个/20μl)为65.2±1.78ng,囊胚内的细胞(40个/20μl)为66.4±1.15ng,escs(40个/20μl)含量为68.23±1.54ng,ipscs(40个/20μl)为60±1.83ng。试验数据表明:mefs在重编程前组蛋白变异体h2a.x蛋白含量低,重编程后形成的ipscs变异体蛋白含量高;早期胚胎阶段,组蛋白变异体h2a.x蛋白总体呈下降趋势。因此,细胞基因组dna的活动性随细胞内组蛋白变异体h2a.x含量的升高而增加。试验四h2a.x对小鼠卵母细胞裂解液逆转化mefs为ipscs效率的影响本研究通过在卵母细胞裂解液重编程mefs的过程中单一添加不同浓度的变异体h2a.x(0ng/20μl、30ng/20μl、60ng/20μl、90ng/20μl和120ng/20μl),探究添加外源性组蛋白变异体H2A.X蛋白是否对卵母细胞裂解液重编程的过程具有促进作用;再通过添加H2A.X蛋白、TSA、5-Aza-dC叁种物质到卵母细胞裂解液中观察重编程MEFs为iPSCs的情况,旨在探讨更快、更安全的卵母细胞裂解液重编程体细胞的方法。最后,通过ELISA检测H2A.X蛋白处理过的MEFs、未经H2A.X蛋白处理的MEFs、H2A.X处理后所得iPSCs、未经H2A.X蛋白处理所得iPSCs中组蛋白变异体H2A.X蛋白水平的变化,进一步探讨组蛋白变异体是如何影响染色质结构继而影响重编程的效率。结果表明:当添加变异体H2A.X蛋白的浓度为60ng/20μl,90ng/20μl和120ng/20μl时,iPSCs集落数(分别为35.67±0.94个、34±0.82个和32.33±1.25个)极显着高于其他处理组(分别为24.63±1.25和28.67±1.70)(P<0.01),添加60ng/20μlH2A.X蛋白所得iPSCs集落数最高;同时加入变异体H2A.X蛋白、TSA和5-Aza-dC,形成的iPSCs集落数(45±0.62个)极显着高于只添加一种或任意两种小分子物质集落数(34.67±0.88个,39±1.10个、41.27±1.4个)(P<0.01);经变异体H2A.X蛋白处理的MEFs的变异体H2A.X蛋白含量为20.8±1.33,极显着高于未经变异体H2A.X蛋白处理MEFs的15.8±0.93(P<0.01),形成的iPSCs的变异体H2A.X蛋白含量差异不明显(P>0.05)。因此,宜采用在卵母细胞裂解液中添加60ng/20μlH2A.X蛋白、50ng/m L TSA和2μg/mL 5-Aza-dC重编程MEFs为iPSCs,经过组蛋白变异体H2A.X蛋白处理后,MEFs的变异体H2A.X蛋白含量明显增加,并且也显着提高了MEFs的重编程效率。结论:宜采用40个/20μl的卵母细胞浓度进行卵母细胞裂解液的重编程,为了提高其重编程的效率,宜添加表观遗传修饰因子:TSA和5-Aza-dC;在重编程逆转化前后,MEFs中组蛋白变异体H2A.X蛋白的含量变化明显,经过变异体H2A.X处理后,其含量明显增加,逆转化效率也得到提高,表明组蛋白H2A.X含量的高低能够影响重编程的效率。组蛋白变异体H2A.X蛋白在早期胚胎发育的过程中变化并不明显,但总体都是高于卵母细胞和MEFs,低于受精卵,表明细胞基因组DNA的活动性随细胞内组蛋白变异体H2A.X含量的升高而增加;组蛋白变异体H2A.X蛋白能够提高卵母细胞裂解液逆转化MEFs形成iPSCs的效率,而且添加DNA甲基化抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂均有助于组蛋白变异体提高卵母细胞裂解物重编程MEFs为iPSCs的能力。(本文来源于《西南大学》期刊2016-05-26）
王洋,盛宇,李钟淑,方南洙,金一[2]（2015）在《茶多酚对鼠胎儿成纤维细胞凋亡的影响》一文中研究指出为探究茶多酚(Tea polyphenols,TP)对体外培养鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibrolast,MEF)凋亡的影响。在MEF细胞培养液中添加质量浓度为0、10、40、70、100和150μg/mL的TP,分别培养24、48、72和96h,使用MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝,MTT法)检测细胞活力;细胞培养72h,以RT-PCR检测B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl-2)、和Bcl相关的蛋白X(Bcl-as-sociated X protein,Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的相对表达量。MTT结果表明:TP质量浓度为40μg/mL时细胞密度略高于其他组,但是没有显着差异(P>0.05);质量浓度为100μg/mL时,对MEF的生长产生抑制作用(P<0.05),细胞形态没有发生明显变化;当质量浓度为150μg/mL时对细胞生长抑制作用明显(P<0.05),从形态观察细胞出现调亡;通过反转录结果表明,对Bax基因、Bcl-2基因和Caspase-3基因的分子转录水平没有影响(P>0.05),表明质量浓度高于100μg/mL TP对MEF生长产生抑制作用,但对Bax基因、Bcl-2基因和Caspase-3转录分子机制无影响。(本文来源于《中国农业大学学报》期刊2015年02期）
王洋[3]（2014）在《茶多酚对鼠胎儿成纤维细胞凋亡的影响》一文中研究指出细胞凋亡(Apoptosis)是生物体内自发发生的细胞生理性的死亡,细胞正常凋亡对维持生物体正常生长发育和维持细胞内环境稳态的作用,细胞异常凋亡能够引发疾病,如癌症和肿瘤等。有报道指出在体外培养的细胞中添加抗氧化剂能够抑制细胞凋亡,茶多酚(Tea polyphenols,TP)是一种天然抗氧化剂,具有多种生物学功能,抗氧化能力比其他抗氧化剂抗氧化能力强很多倍,对体外培养细胞主要用于癌细胞和肿瘤细胞的研究,且对抑制癌细胞和肿瘤细胞的生长作用效果显着,研究表明,TP具有抗癌和抗肿瘤的作用,但是在体细胞培养液中添加TP对体外培养鼠胎儿成纤维细胞凋亡效果的影响尚未见报道。[目的]：本试验主要通过体外培养MEF细胞,用不同浓度的TP培养液处理细胞,研究不同浓度的茶多酚培养液对鼠胎儿成纤维细胞存活率和细胞形态变化的影响,并应用反转录方法检测抗凋亡基因Bcl-2基因、促凋亡Bax基因和促凋亡基因Casase-3从分子水平上检测基因表达量的变化,用来确定天然抗氧化剂茶多酚对鼠胎儿成纤维细胞凋亡效果的影响。[方法]：1.取妊娠12.5天昆明白母鼠,热消化法分离原代细胞进行培养,差速贴壁法纯化细胞,传至第3代,绘制细胞生长曲线,检测细胞活力。2.用含有不同浓度的茶多酚培养液培养细胞,分别培养24h、36h、72h、96h,倒置显微镜观察细胞形态,用MTT法进行细胞存活率的检测,比较添加不同浓度茶多酚培养液对细胞存活率的影响。3.用不同浓度的茶多酚培养液处理细胞,培养72h,分别提取细胞总RNA,进行RT-PCR反应,反转录合成目的基因Bax基因、Bcl-2基因和Caspase-3基因,琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行检测,使用软件进行条带灰度值的检测,比较基因的相对表达量。[结论]：通过细胞生长曲线确定了3代细胞适合试验用,不同浓度的茶多酚培养液处理细胞后对鼠胎儿成纤维细胞生存率和形态的影响为：当茶多酚浓度低于100mg/L时,MTT结果为72h时,对细胞促进作用最明显,96h时,细胞生存率低于72h时,可能是细胞正常生长的结果。对鼠胎儿成纤维细胞的生长具有促进作用,并且细胞形态没有发生明显的变化,通过实验结果,当浓度为40mg/mL时促进作用略微明显,高于细胞对照组,但是没有显着差异,当细胞浓度高于100mg/mL时对细胞生长具有抑制作用,从形态学观察出细胞出现调亡现象。通过反转录结果表明在Bax基因、Bcl-2基因和Caspase-3基因的分子途径上没有什么影响,因此,TP各个浓度处理组中基因相对表达量没有显着性差异。证明了适宜浓度TP对MEF细胞生长具有正向的保护作用但是在凋亡基因bcl-2、bax和caspase-3表达途径上无影响,其他机理还有待进一步研究。(本文来源于《延边大学》期刊2014-05-19）
秦莹[4]（2013）在《Nramp1基因的克隆及其在羊胎儿成纤维细胞和转基因小鼠中的表达鉴定研究》一文中研究指出巨噬细胞天然抵抗力相关蛋白基因（Natural Resistance associated MacrophageProtein1gene, Nramp1）也被称作Slc11a1基因，在小鼠中对细胞内病原体的抵抗起着关键性的作用，如各种沙门氏菌（Salmonella）血清型、分枝杆菌（Mycobacterium lepraemurium）、胞内分枝杆菌（M. intracellulare）、牛分枝杆菌（M.bovis）和杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）等。Nramp1蛋白在巨噬细胞中主要表达在吞噬溶酶体膜上，在感染的早期阶段通过其阳离子运输功能限制胞内病原的增值，以增强巨噬细胞抵抗病原体的能力，它可以改变巨噬细胞内部的铁代谢，包括使细胞质的含铁量减少，增强细胞铁输出，来限制胞内菌对铁的利用。Nramp1也被证明参与巨噬细胞吞噬红细胞时铁的回收利用。同时它还参与一些免疫信号通路活性的调节，如由增加抗菌效应分子的产生（如ROS和RNS）或通过Nramp1降低IL-10的表达促进NO的产生。山羊Nramp1基因全长1647bp，定位于山羊2号常染色体长臂q12.2。在各个组织中，Nramp1主要分布于脾脏和肝脏，在其他组织中表达量很少或没有表达，其中，脾脏的表达量最高。本研究通过提取山羊脾脏总RNA，经RT-PCR获得Nramp1基因序列，将其插入真核表达载体PcDNA3.1(+)，构建重组质粒PcDNA3.1(+)-Nramp1，将线性化的质粒转染羊胎儿成纤维细胞，筛选获得阳性细胞克隆，在基因组和RNA水平对细胞系进行检测，获得阳性细胞系两株。同时用原核注射的方法将载体注入小鼠0.5d受精胚胎，通过胚胎移植获得转基因小鼠，对转基因小鼠进行基因组和RNA水平检测，获得阳性转基因小鼠两只，对转基因小鼠Nramp1的组织分布进行检测，结果表明该基因在心、脾、肺、肾、睾丸、肌肉、鼠尾等组织均有表达，在肝脏表达量很少或没有表达。(本文来源于《吉林大学》期刊2013-06-01）
周家庆[5]（2013）在《不同转座子在猪和鼠胎儿成纤维细胞中转座活性的比较研究》一文中研究指出转座子(Transposon, Tn),是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,转座子从一个基因位点插入到另一个基因位点的过程称为转座。Sleeping beauty (SB)、piggyBack(PB)、Tol2是目前研究应用较多的3种DNA转座子。为了探讨此3个转座子系统的转座特性,本研究将含转座元件的重组表达载体转染哺乳动物猪和小鼠胎儿成纤维细胞(PEF和MEF),通过优化相关参数,系统比较了转座活性差异,为转基因和功能基因捕获研究提供重要参考。本实验主要包括：1.用高保真PCR法克隆绿色荧光蛋白eGFP编码区,经序列测定正确后,亚克隆至载体pGL3-SV40启动子下游,然后将SV40-EGFP表达框克隆至SB转座子载体pT2-HB,构建成转座子表达载体,命名为pT2-SV40-EGFP。将此重组质粒经脂质体Lipo-fectamineTM2000包裹转染猪胎儿成纤维细胞(PEF),48小时后通过荧光显微镜观察报告基因的表达。结果表明,PEF细胞转染率较高(大于50%),且PT2-SV40-EGFP能有效表达。提示Lipo-fectamineTM2000可高效包裹转座子载体转染胎儿成纤维细胞,为后继实验提供参考。2.用分子克隆方法将PB和To12转座元件克隆至pT2-HB,从而构建成含叁种转座子的重组载体,命名为pT3-PST:再用内切酶将CAG-GFP表达盒从载体pCAG-GFP中切出,亚克隆至pT3-PST,构建成表GFP的多转座子载体,命名为pT3-PST-CAG-GFP载体。将此重组载体用上述方法转染猪胎儿成纤维细胞(PEF)和小鼠胎儿成纤维细胞(MEF),结果表明,pT3-PST-CAG-GFP载体在两种细胞中均能有效转染和表达,提示该载体构建成功,可用于转座特性研究。3.为了比较SB11、SB16、SB100x叁种转座酶的转座活性,按照DNA质量比10：1比例将pT3-PST-CAG-GFP和表达上述叁种转座酶的载体分别混合,经脂质体包裹转染PEF和MEF。通过荧光显微镜和荧光定量PCR法(RT-QPCR)检测GFP表达水平和插入效率。结果表明,SB100x介导外源基因插入基因组拷贝数及GFP转录水平均显着高于SB11和SB16,提示SB100x具有较高转座活性,可用于SB转座系统特性研究。4.为了比较SB、PB和To12转座子的转座效率,将pT3-PST-CAG-GFP分别和叁种转座酶载体SB100x、PBase及Tol2TBase共转染PEF和MEF细胞,同时设置不同的质量比梯度：10：1、5：1、1：1、1：5和1：10。通过荧光显微镜和RT-QPCR法检测GFP表达水平和插入效率。结果表明,SB介导外源基因插入基因组拷贝数及GFP转录水平均显着高于PB和Tol2,提示SB系统转座活性优于PB和Tol2。结果还表明叁者获得最高转座率的转染质量比不同,其中SB、PB在PEF及MEF中最高转座率的转染质量比相同,SB系统为1：1,PB系统为1：10,Tol2系统在PEF及MEF中最高转座率的转染质量比不同,PEF中为1：10,MEF中为1：5。上述实验结果表明：SB、PB和Tol2叁种转座子介导的表达载体均能在PEF和MEF细胞高效转座和表达；SB转座活性高于PB和To12; SB系统存在转座酶过量抑制效应,而PB和Tol2则不存在明显的过量抑制效应。(本文来源于《扬州大学》期刊2013-05-01）
肖雄[6]（2012）在《应用小鼠胚胎干细胞（ESCs）裂解液逆转化胎儿成纤维细胞（MEFs）为诱导性多能干细胞（iPSCs）的研究》一文中研究指出诱导已分化体细胞发生去分化并形成类似于ESCs多能性细胞特征的过程称作“体细胞重编程”。从ESCs裂解液中提取活性物质诱导已分化体细胞重编程为多能干细胞的过程,既没有诱导性干细胞基因组染色质的直接参与,也没有被诱导体细胞基因组DNA结构序列的变化；研究ESCs提取物中有活性细胞因子的作用,有利于发现和识别与重编程相关的细胞因子及其表达调控机制,并进而研究其相互作用关系；因为ESCs的提取物直接诱导靶细胞使其发生了生物学变化,而没有引起靶细胞基因组碱基序列发生结构学变化,不会使靶细胞发生遗传学变异,因此,应用这项技术对体细胞重编程所诱导形成的多能干细胞具有更好的生物安全性；以上种种优势赋予这项研究内容在生物医学领域具有重要的理论价值和广阔的应用前景。本研究通过优化小鼠体内受精囊胚、杂合二倍体孤雌囊胚、人工重组异期卵母细胞核二倍体孤雌囊胚(含有速激核成熟新生鼠生长初期卵母细胞与成熟卵母细胞基因组二倍体小鼠孤雌囊胚)的获取途径,获得不同囊胚来源的ESCs。采用形态学观察法、碱性磷酸酶(AKP)染色法、核型分析法、Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学检测法、Oct-4基因和Sox-2基因表达检测法、类胚体(EB)分化能力检测等方法对其ESCs的特性进行鉴定。用于被诱导的受体MEFs,采用曲古抑菌素A(TSA)和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-dc)预处理,然后再经过适宜浓度链球菌溶血素O(SLO)渗透化处理；用于起诱导作用的不同囊胚来源的小鼠ESCs,采用液氮反复冻融和离心的方法,得到不同类型ESCs的无细胞裂解液；将受体细胞孵育在无细胞裂解液的培养液中进行重编程逆转化性诱导培养,获得来源于体细胞的多能干细胞。对诱导所得多能干细胞进行多能干细胞特性的鉴定。借助双重PCR性别鉴定的方法,分选出来源于雌性的有性生殖ESCs,孤雌胚胎干细胞(pESCs)和重构pESCs,叁种雌性胚胎干细胞分别通过冻融和离心的方法,获得叁种不同类型雌性ESCs(供体细胞)的无细胞裂解液,将此作为诱导剂重编程逆转化雄性MEFs(受体细胞),获得多能干细胞后,依据供体细胞和受体细胞的性别差异,采用双重PCR性别鉴定的方法确定重编程所得多能干细胞集落的来源。最后以鸡成纤维细胞作为重编程的受体细胞,探讨小鼠ESCs裂解液进行种间体细胞重编程、逆转化鸡胚成纤维细胞形成多能干细胞的可行性,并通过核型分析鉴定其所得多能干细胞的来源。通过上述研究,旨在比较不同来源ESCs裂解液介导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的可能性及其效率,筛选适宜的共孵育方式,验证重编程体系的可靠性,比较有性生殖ESCs和无性生殖pESCs裂解液的作用效果,进一步研究父本基因缺失情况下对体细胞重编程逆转化效率的作用和对异种动物体细胞诱导形成多能干细胞的可能性。这项研究结果将为今后进一步探索ESCs和pESCs裂解液中重编程有效成分的筛选、鉴定和物种间多能干细胞的研究奠定基础。研究结果如下：1.用于分离小鼠ESCs(?)勺叁种囊胚有效生成途径研究1.1小鼠体内受精囊胚内细胞团(ICM)集落获取的条件优化本研究首先通过比较不同胎龄MEFs的生长状况和连续传代过程中细胞的生长情况,研究影响MEFs分离和培养效率的因素,旨在为早期胚胎共培养体系选择更加有效的MEFs的分离培养体系,用于MEFs饲养层的制备、ESCs的分离培养和被诱导受体细胞的筛查处理。然后,采集3.5d、4d和4.5d胎龄的胚胎,分别移入DMEM培养液、DMEM+白血病抑制因子(LIF)培养液和包含有MEFs贴壁生长细胞的共培养体系中进行体外培养,比较叁种培养体系中ICM孵出的时间、孵化囊胚贴壁比率和ICM集落形成比率,旨在筛选获取优质ICM集落的实验方法,为ESCs(?)勺分离培养奠定基础。结果表明：采用12.5-14.5d胎龄的小鼠胎儿分禺MEFs,传代培养后选取第3代MEFs制备饲养层,采集4d的小鼠囊胚置于其MEFs饲养层的共培养体系中,经体外培养3-4d,可以获取优质的ICM,这为体内受精囊胚来源ESCs的分离培养奠定了基础。1.2小鼠杂合二倍体孤雌囊胚生成途径的优化本研究采用5种化学激活方法即乙醇、乙醇+6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)、乙醇+6-DMAP+细胞松弛素B (CB)、SrCl2、SrCl2+CB处理小鼠成熟卵母细胞,通过观察激活卵母细胞第二极体排出情况和核型分析,探讨不同激活方法所得激活卵母细胞染色体倍性的倾向类型,比较不同染色体倍性激活卵母细胞的体外发育能力,筛选有利于形成杂合二倍体孤雌囊胚的激活方法。结果表明：在含有10%乙醇培养液中激活卵母细胞5min的基础上,添加6-DMAP有利于抑制第二极体的排出,促进双原核(2PN)杂合二倍体孤雌胚胎的形成,获取更高的过二细胞阻滞率和桑葚胚/囊胚发育率；采用含有10mM SrCl2和CB处理卵母细胞4h,也能够获取较多的双原核(2PN)杂合二倍体和较高的桑葚胚/囊胚发育率,因此,以上两种孤雌激活方法适宜用于获取小鼠杂合二倍体孤雌囊胚。1.3人工重组异期卵母细胞核二倍体孤雌囊胚(含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和M Ⅱ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎)的构建本研究分别研究了CB对生发泡(GV)期卵母细胞去核效果的影响、去除成年小鼠MⅠ期卵母细胞GV的方法选择、新生小鼠生长初期卵母细胞与去核GV期卵母细胞黏合体系的筛选、电融合条件选择以及重构胚化学激活方法的筛选等,旨在构建含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎,用于ESCs的分离。结果表明：预先采用10μg/mL CB溶液处理GV期卵母细胞,0.5%链霉蛋白酶去除GV期卵母细胞的透明带,显微操作仪上去除生发泡,将去除生发泡的GV期卵母细胞与新生小鼠生长初期卵母细胞移入自制凹窝内进行黏合,选择1.5KV/cm-2.0KV/cm的电场强度、40μS的脉冲宽度对黏合细胞进行电击,发生电融合和电激活,获得排出了第一极体的速激核成熟重构卵母细胞。利用显微操作仪将重构卵母细胞的核区移植到去除第一极体的MⅡ期成熟卵母细胞的透明带下,通过电融合使两者发生融合,形成含有两个MⅡ期卵母细胞核的重构卵细胞,再经过对其进行7%乙醇(5min)联合2.5mmol/L6-DMAP (4h)(?)勺激活后用于体外培养,可以构建出含有速激核成熟新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞基因组的二倍体孤雌胚胎。2.小鼠ESCs、pESCs和重构pESCs(?)勺分离、培养与鉴定2.1小鼠体内受精囊胚ESCs的分离、培养与鉴定本研究采集13.5d胎龄的胎儿分离MEFs,选取第3代MEFs制备饲养层；分别采用全胚法和免疫外科法从4d胚龄的囊胚中获取ICM,将ICM小团块移到饲养层上进行增殖培养,观察集落形态,并对细胞集落进行多能性鉴定。结果表明：采用全胚法和免疫外科法均能分离得到小鼠ESCs集落,其集落形成率差异不显着(30.26±2.77%vs32.92±4.37%,P>0.05)。两种方法所得ESCs集落具有典型的ESCs形态特征,AKP染色阳性,ESCs的染色体为二倍体,具有正常核型,Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学检测为阳性,RT-PCR检测表明ESCs表达多能性基因：Oct-4和Sox-2, RT-PCR检测显示EB中叁个胚层的标记基因(Fgf-5、Bra T和Afp)均为阳性。2.2昆明小鼠孤雌囊胚来源pESCs的分离、培养与鉴定鉴于孤雌囊胚于体外培养时间过长,胚胎难以突破透明带引起囊胚孵化率和贴壁率降低的情况,本研究选用免疫外科法分离单倍体pESCs(源自SrCl2激活卵母细胞4h所得囊胚)和二倍体pESCs(源自10mM SrCl2+5μg/mL CB激活卵母细胞4h所得囊胚),并对所得细胞进行多能性鉴定,旨在探讨孤雌囊胚染色体倍性对pESCs分离和培养效率的影响,筛选适宜倍性的孤雌囊胚获取pESCs。(?)吉果表明：本研究所得到的pESCs集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定效果。从二倍体孤雌囊胚分离所得pESCs的集落形成率显着高于单倍体孤雌囊胚处理组(13.54±4.43%vs7.17±4.45%,P<0.05),宜选择有利于提高二倍体孤雌囊胚形成率的激活方法进行pESCs的分离。2.3异期二倍染色体重构胚胎来源pESCs的分离、培养与鉴定本研究通过构建包含有新生小鼠生长初期卵母细胞和MⅡ期卵母细胞的二倍染色体重构核型孤雌胚胎,经体外培养获得囊胚,采用全胚法分离pESCs,并对所得重构pESCs进行多能性鉴定。结果表明：将融合后发育至桑葚胚期和囊胚期的180枚胚胎转移到MEFs饲养层上,48h后从透明带中孵出并贴壁于饲养层上,96h后ICM长出并开始增殖,5d后ICM增殖成柱状,挑出消化离散成细胞小团块后,5d后可见形成了26个pESCs集落,其集落形成率为14.43±4.36%。所得集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定效果。3.应用小鼠ESCs裂解液重编程逆转化MEFs为多能干细胞的研究3.1不同浓度SLO对MEFs生长状态的影响本试验采用不同浓度SLO处理MEFs,通过比较SLO处理下MEFs的细胞密度、存活率和贴壁率,并绘制适宜浓度SLO处理后MEFs的生长曲线,研究不同浓度SLO对MEFs生长状态的影响,探讨SLO对体细胞的损伤是否具有剂量依赖性,以便筛选适宜浓度的SLO用于重编程体细胞的渗透化处理。结果表明：25USLO处理组的细胞密度和经CaCl2封膜后继续培养的细胞贴壁率分别与10U SLO处理组之间差异不显着(p>0.05),分别极显着地高于50U和100U SLO处理组(p<0.01)。第3代MEFs经25USLO渗透化处理后细胞仍具有正常分裂增殖的生长模式,说明该浓度的SLO对MEFs的分裂增殖影响较小。因此,宜选用25U SLO对重编程MEFs进行渗透化处理。3.2昆明小鼠ESCs裂解液的制备本研究比较了两种机械性裂解法即超声波处理法和液氮反复冻融法对ESCs裂解液制备效果的影响,并对所得裂解液进行体外培养试验和加入未经SLO渗透化处理的MEFs后的Oct-4免疫细胞化学染色,尽可能地排除ESCs完整细胞或细胞碎片残留等造成裂解液诱导体细胞重编程的假阳性,旨在探讨适宜的ESCs裂解方法,以获得用于体细胞重编程的高效ESCs裂解液。结果表明：液氮反复冻融7次可使ESCs细胞绝大部分发生裂解,获得的总蛋白质浓度显着高于超声波裂解细胞处理组(35.6mg/mL vs14.3mg/mL)。裂解液经体外培养后未见MEFs饲养层上生长有ESCs集落,AKP染色也未见红棕色细胞,Oct-4免疫细胞化学染色MEFs为阴性反应。因此,宜选择液氮反复冻融7次的方法制备用于体细胞重编程的ESCs裂解液。3.3小鼠ESCs裂解液与MEFs共孵育体系的研究本研究首先探讨了供、受体细胞的性别属性对ESCs裂解液诱导体细胞重编程效率的影响,结果表明供、受体细胞性别对ESCs裂解液诱导MEFs重编程所得多能干细胞集落数量无显着差异。然后,比较了叁种不同来源囊胚分离所得雌性ESCs裂解液重编程雄性MEFs或经过TSA和5-aza-dC预处理的雄性MEFs为多能干细胞的效率,以雄性MEFs与其自身裂解液共孵育和未经裂解液处理的雄性MEFs作为对照组,并对所得多能干细胞进行鉴定,旨在探讨适宜的裂解液诱导体细胞重编程体系。结果表明：体内受精囊胚来源并经双重PCR性别鉴定为雌性的ESCs裂解液、孤雌囊胚ESCs裂解液和重构囊胚来源ESCs裂解液均能够重编程雄性MEFs为多能干细胞,这些多能干细胞集落具有与体内受精囊胚来源ESCs类似的多能性鉴定指标表现。在重编程所得多能干细胞集落数量上,体内受精囊胚来源雌性ESCs裂解液处理组(64.33±3.7个、80.67±2.08个)>重构囊胚来源ESCs裂解液处理组(45.00±4.36个、53.67±3.06个)>孤雌囊胚处理组(35.67±2.52个47.67±4.16个)；TSA和5-Aza-dC的预处理有助于促进雄性MEFs的重编程,但是,在没有ESCs裂解液的诱导作用下,仅采用TSA和5-Aza-dC预处理雄性MEFs并不能获得多能干细胞集落；无ESCs裂解液参与的单纯重编程操作过程和雄性的MEFs裂解液并不能使雄性MEFs发生重编程,因此,促使雄性MEFs发生重编程的物质来源于ESCs的裂解液。4. ESCs裂解液诱导MEFs重编程所得多能干细胞集落的来源鉴定采用双重PCR性别鉴定方法对体内受精囊胚来源经性别鉴定为雌性ESCs裂解液、孤雌囊胚来源pESCs裂解液和重构孤雌囊胚来源ESCs裂解液诱导雄性MEFs重编程所得到的多能干细胞进行性别鉴定,鉴定所得多能干细胞的来源,判定细胞提取物诱导的重编程体系的可靠性。结果表明：体内受精囊胚来源经性别鉴定为雌性ESCs的裂解液、孤雌囊胚来源pESCs裂解液和重构孤雌囊胚来源的ESCs裂解液均能够诱导雄性MEFs重编程为多能干细胞,所得多能干细胞的基因组DNA中具有250bp的Sry基因序列片段和339bp的ZFX基因序列片段,为雄性细胞。因此,pESCs裂解液重编程所得具有多能性特征的细胞是源自于雄性MEFs,它们所表现出的多能性检测指标的阳性反应并不是由于裂解液制备过程中的ESCs污染所致。5. ESCs裂解液诱导种间体细胞重编程的可行性研究本研究以鸡胚成纤维细胞作为重编程的受体细胞,采用小鼠体内受精囊胚来源ESCs裂解液与其进行共孵育,通过形态学观察,研究其对鸡胚成纤维细胞的逆转化效果,对所获得干细胞集落进行多能性检测,旨在探讨小鼠ESCs裂解液作用于异种体细胞后,使其重编程逆转化为多潜能干细胞的可行性。结果表明：与小鼠ESCs裂解液共孵育的鸡胚成纤维细胞均变为圆形细胞,未见梭形的贴壁细胞,形成了42.33±4.5个细胞集落。细胞集落经AKP染色和Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色,均呈阳性反应。表明小鼠ESCs裂解液重编程鸡胚成纤维细胞后,所获得的细胞集落表现出一定的多能干细胞特性,经核型分析表明这些细胞来源于鸡胚成纤维细胞。单独的重编程操作过程和与鸡胚成纤维细胞裂解液共孵育,均无法将鸡胚成纤维细胞重编程为具有ESCs多能性特征的干细胞,说明参与重编程鸡胚成纤维细胞的物质来源于小鼠ESCs的裂解液。结果表明,ESCs裂解液诱导体细胞重编程逆转化为多能干细胞的作用也能够在小鼠和鸡的种间发生。总结论：通过共孵育(或者共培养)途径应用ESCs的无细胞裂解液作为诱导剂,能够在较短的时间内(处理后1天内呈现细胞形态学显着变化成为圆形细胞；4天内形成边界清晰的细胞集落；共孵育后第3天细胞集落表现AKP活性,第7天细胞表达Oct-4、Sox-2和Nanog基因)逆转化经过SLO、TSA和5-Aza-dC预处理的MEFs成为多能干细胞；应用这个逆转化体细胞成为多能干细胞的细胞培养体系,使用同样的预处理体细胞的方法,也能够诱导异种鸡胚成纤维细胞成为多能干细胞。(本文来源于《西南大学》期刊2012-10-20）
丛姗,王瑞,温建勋,郝斐,李硕[7]（2012）在《牛和小鼠胎儿成纤维细胞混合制成的饲养层对牛胚胎干细胞的体外培养》一文中研究指出【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)和牛胎儿成纤维细胞(bovine embryonic fibroblast,BEF),用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显着堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。(本文来源于《中国农业科学》期刊2012年12期）
肖雄,赵海龙,邓玉金,邱小燕,王炜[8]（2012）在《不同浓度链球菌溶血素O对小鼠胎儿成纤维细胞生长状态的影响》一文中研究指出本研究比较了0、10、25、50 U或100 U链球菌溶血素O(SLO)处理下的小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)的细胞密度、存活率、贴壁率,并绘制了适宜浓度SLO下MEFs的生长曲线。结果表明:25 U SLO处理组的细胞密度与10 U SLO处理组间差异不显着(P>0.05),但极显着高于50 U和100 U SLO处理组(P<0.01)。0、10 U和25 USLO处理组的细胞存活率差异不显着(P>0.05),但显着高于50 U处理组(P<0.05)。25 U SLO处理组的贴壁率极显着高于50 U和100 U SLO处理组(P<0.01)。25 U SLO处理组MEFs具有正常分裂增殖生长模式。因此,为了既能达到SLO对MEFs细胞膜的渗透化效果,又尽可能减少对细胞的损伤,宜选用25 U SLO进行MEFs的渗透化处理。(本文来源于《中国畜牧杂志》期刊2012年09期）
何允[9]（2012）在《小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究》一文中研究指出哺乳动物的早期性别鉴定是人为进行性别控制的手段之一。在畜牧业生产中,通过性别控制能够建立优化商品畜群,充分发挥母畜的繁殖能力及公畜的生长优势,提高畜产品经济效益,并能够在生产前排除潜在有害基因型,防止性连锁疾病；在分子生物学、胚胎细胞学及发育遗传学等基础学科的研究中,胚胎性别鉴定是探索胚胎发育机制、深化干细胞研究、实现肿瘤分子调控等热点研究课题的环节之一；胚胎成纤维细胞具有细胞体积大数目多、来源广泛且取材方便以及在体外培养条件下能够迅速生长繁殖,并且能够长期传代等优点,广泛应用于胚胎干细胞的分离与培养、体细胞克隆与核移植等课题的研究,因此小鼠早期胚胎及成纤维细胞的性别鉴定在畜牧生产、遗传育种、胚胎发育学及临床应用范围内均具有实用价值。本课题使用双重PCR法对小鼠附植前8-细胞胚胎以及小鼠胎儿成纤维细胞进行了性别鉴定,旨在探寻一种简便可靠的双重PCR性别鉴定方法,为小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植等研究提供参考。具体内容包括：(1)引物设计及其合理性检测：以雄性特异性SRY基因序列设计了一对特异性引物,即上游引物SRY250U:5’-CTTTTTCCAGGAGGCACAGA-3’及下游引物SRY250L:5’-GACAGGCTGCCAATAAAAGC-3’;以雄性及雌性共有的锌指结构ZFX基因序列设计另一对内标引物,ZFX399U 5’-AAGAGAGTCCATTCAAGTGTGA-3’为上游引物,ZXF399L: 5’-GCTACCTTTGTTGCCGAAAT-3’为下游引物；使用离心柱式动物基因组DNA提取试剂盒提取小鼠肝脏组织DNA基因组作为模板,在适宜的反应体系及条件下,分别用两对引物进行体外扩增,扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳进行结果检测。结果表明SRY基因引物对能够对雄性基因组扩增出约250bp的目标条带,雌性基因组扩增结果为空白,而ZFX基因引物对可对雄性及雌性小鼠肝脏组织基因组均扩增出399bp大小的目标条带；使用已知性别小鼠肝脏基因组为模板,同时用两对引物进行扩增,结果雄性小鼠扩增结果为内标条带及判断条带同时存在,而雌性小鼠扩增结果为399bp一个条带,说明试验所设计引物具备有效性及合理性；(2)将适龄健康的雌鼠注射PMSG和hCG后与雄鼠合笼,将见栓后2d的雌鼠进行无菌手术,取出子宫并以M2操作液冲洗,得到2.5d胚龄的胚胎。将所得胚胎经0.5%链霉蛋白酶于37℃处理30s去除透明带,M2操作液洗涤后,从每个8-细胞胚胎吸取4个卵裂球用于性别鉴定；将卵裂球加入8μL ddH_((2))O后以5μL石蜡油覆盖,恒温煮沸5mmin后-20℃冰浴5min,14000rpm离心2mmin,取上清液用于扩增,扩增体系为：ddH_((2))O7μl；10×Buffer 3μl；Mg~((2=))=2μl；10×Taq Buffer 2.5μl；dNTP 3μl；引物P11μl；引物P_((2)) 1μl；DNA样本5μl；Taq酶1.5μl；反应条件为：预变性94℃,5min；变性94℃,30s；退火60℃,35s；延伸72℃,40s,共30个循环；72℃,10min,4℃保存。扩增结束后取5μl产物在1.5%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对40枚小鼠附植前胚胎进行性别鉴定,结果显示其中20枚胚胎电泳检测扩增结果出现250bp大小的判断条带及399bp大小的内标条带,由此判断此20枚附植前胚胎为雄性胚胎；12枚8-细胞胚胎卵裂球提取DNA后进行体外扩增后,电泳结果显示399bp大小的内标条带,判断条带为阴性,因此判断为雌性胚胎；另有8枚胚胎因条带缺失或模糊不明无法进行性别判断。性别鉴定成功率为80.00%。(3)将适龄健康的雌鼠注射激素后与雄鼠合笼,13d后将雌鼠处死进行无菌手术,摘取完整子宫并以取出13.5d胎龄的胎鼠用于分离MEFs；将所得MEFs的细胞密度调整至1×106个/ml,于37℃、5%C02、饱和湿度培养箱中培养,每24h换液一次,待80-90%细胞贴壁时进行传代培养,并观察贴壁情况,得出F3代MEF贴壁及发育状况均优于其他代细胞；取第3代MEFs按离心柱型细胞基因组DNA提取试剂盒提取总DNA；使用自主设计的SRY基因引物及ZFX基因引物对MEFs DNA进行体外扩增,扩增体系为：ddH_((2))O 7μl；10×Buffer 3μl；Mg~((2=))2μl；10×Taq Buffer 2.5μl；dNTP 3μl；引物P1 1μl；引物P_((2))1μl；DNA样本5μl；Taq酶1.5μl；反应条件为：预变性94℃,5min；变性94℃,30s；退火60℃,35s；延伸72℃,40s,共30个循环；72℃,10min,4℃保存。扩增结束后取5μl产物在1.5%琼脂糖电泳上电泳检查结果。本试验共对30只小鼠13.5d胎儿所制备的第3代MEFs进行了性别鉴定,结果表明其中13个MEFs为雄性,电泳结果同时显示大小为250bp的判断条带及399bp大小的内标条带,7个MEFs为雌性,其DNA样本体外扩增电泳结果仅显示ZFX基因内标条带,另有10个细胞系由于条带缺失无法进行性别判断,其检出率为66.67%。本试验自主设计了雄性小鼠特异性SRY基因引物对及雌雄小鼠共有的ZXF基因引物对,并以已知性别小鼠肝脏基因组作为模板进行体外扩增,对引物合理性及有效性进行了检测,成功地建立了双重PCR性别鉴定体系；根据此体系对小鼠附植前胚胎及MEFs进行了双重PCR性别鉴定,其检出率分别达到80.00%及66.67%。通过对试验结果的分析讨论得出,从8-细胞胚胎中吸取4个卵裂球为体外扩增的适宜模板量,从13.5d胎龄制备的MEFs经过3次传代后贴壁发育情况较优,适宜用于提取基因组进行性别鉴定,此结论对小鼠ES细胞培养、体细胞克隆及胚胎移植的研究提供了参考,具有一定实际意义。(本文来源于《西南大学》期刊2012-05-07）
张翠平[10]（2012）在《诱导小鼠胎儿成纤维细胞为多能干细胞的共孵育方法研究》一文中研究指出本试验将完全分化的小鼠胎儿成纤维细胞(MEFs)经渗透化处理后与小鼠类胚胎干细胞(ES细胞)裂解液共孵育,建立共孵育重编程逆转化方法,探讨诱导MEFs逆转化为多能干细胞的可能性。重点研究了小鼠类ES细胞的裂解方法及裂解液的有效提取方式、在裂解液中添加不同物质组成共孵育逆转化配方、MEFs的渗透化处理方法和MEFs在不同的共孵育体系中人工诱导逆转化为多能干细胞的效果等,旨在构建新的共孵育重编程逆转化体系提高人工诱导MEFs为多能干细胞的效率。试验一：共孵育重编程逆转化体系中小鼠类ES细胞的有效生成途径及其影响因素研究以昆明系小鼠为实验动物,采集妊娠3.5d、4d和4.5d的胚胎,分别移入DMEM培养液、DMEM+白血病抑制因子(LIF)和MEFs共培养体系中进行培养,比较内细胞团(ICM)从透明带内孵出的时间、孵化囊胚的贴壁情况以及ICM集落的形成情况,旨在筛选获取优质ICM集落的试验方法,为进一步有效分离、培养和鉴定类ES细胞并用于后续试验的裂解过程奠定基础。结果表明：妊娠3.5d的胚胎有61%为桑葚胚,需要经过4-5d的体外培养才能形成ICM集落,妊娠4d的扩张囊胚经过3-4d的共培养后形成ICM集落,妊娠4.5d的孵化囊胚经过1-2d的共培养即可形成ICM集落；ICM集落形成率差异极显着(P<0.01),妊娠4.5d的胚胎ICM集落形成率最高,其次为妊娠4d的胚胎,但妊娠4.5d冲出孵化囊胚数量明显减少；MEFs共培养体系优于DMEM和DMEM+LIF培养体系。因此,采集妊娠4d的昆明小鼠胚胎,选择MEFs共培养体系,在体外培养3～4d,能够有效地分离培养出可用于ES细胞研究的优质ICM集落。试验二：昆明小鼠类ES细胞裂解液的生成及其无细胞共孵育培养体系研究选取优质ICM集落进行传代培养得到类ES细胞集落,采用液氮冻融细胞法和显微计数细胞消失法,将类ES细胞分别在液氮中冻融3次、5次、7次和9次,比较不同试验组尚存完整细胞的个数,旨在探讨能够使类ES细胞完全裂解且细胞内大分子物质较少受到破坏的冻融临界次数,以便获得能够保持较多干细胞生理活性物质特性的无细胞共孵育培养体系。结果表明：类ES细胞裂解3次的完整细胞数与裂解5次、7次、9次差异极显着(P<0.01),裂解3次类ES细胞并未完全被破坏,还含有很多完整细胞,类ES细胞裂解5次、7次、9次完整细胞数差异不显着(P>0.05),类ES细胞集落裂解5次仍有完整细胞,裂解7次、9次无完整细胞。因此,选取液氮反复处理7次的类ES细胞裂解液用于MEFs重编程的无细胞共孵育培养体系比较合适。试验叁：共孵育重编程逆转化体系中MEFs的优化选择和渗透化处理方式研究以昆明系小鼠为实验动物,采集妊娠13.5d的小鼠胚胎,分离培养MEFs并将其传至第3代,选择不同浓度链球菌溶血素O (SLO)影响MEFs细胞膜的稳定性,探讨增加MEFs细胞膜渗透性并能通过较大生理活性物质的渗透化处理方法。试验分别采用0.1U·μL-1、0.25·μL-1、0.5·μL-1、1·μL-1SLO处理MEFs,然后在显微镜下观察并记录死亡细胞数,旨在筛选渗透化处理MEFs的适宜SLO浓度。结果表明：经0.5·μL-1、1·μL-1SLO处理的MEFs死亡细胞数较多,影响MEFs逆转化为多能干细胞的效率；经0.1·μL-1、0.25·μL-1的SLO处理的MEFs死亡细胞数较少,且两处理组差异不显着(P>0.05),考虑到SLO的浓度过低很可能造成MEFs渗透化处理不完全,最终影响MEFs的逆转化效率。因此,选取0.25·μL-1的SLO作用于MEFs既有望得到较好的渗透化处理效果,又可以尽量不破坏MEFs,为进一步研究MEFs和类ES细胞裂解液共孵育重编程体系奠定基础。试验四：不同的类ES细胞裂解液共孵育培养体系诱导MEFs逆转化为多能干细胞的效果观察将经过SLO预处理的MEFs分别移入类ES细胞裂解液组(Ⅰ组)、曲古抑菌素(TSA)和SLO预处理MEFs+类ES细胞裂解液处理组(Ⅱ组)、5-氮脱氧胞苷酸(5-Aza-dC)和SLO预处理MEFs+类ES细胞裂解液处理组(Ⅲ组)、TSA+5-Aza-dC和SLO预处理MEFs+类ES细胞裂解液(Ⅳ组)四组共孵育逆转化体系中作用,并与无裂解液组作对照,对MEFs的形态学变化进行观察,并对重编程逆转化所得多能干细胞进行鉴定,研究不同的类ES细胞裂解液共孵育培养体系诱导MEFs逆转化为多能干细胞的效果,确定能够有效诱导MEFs为多能干细胞的共孵育方法。结果显示：试验Ⅳ组的非圆形细胞个数与共孵育方式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间差异极显着(P<0.01),试验Ⅳ组类ES细胞集落个数明显优于其它叁个处理组(P<0.01)。因此,在类ES细胞裂解液共孵育前使用TSA和5-Aza-dC两种物质预先处理MEFs更有利于提高MEFs逆转化为多能干细胞的效率。结论：采集妊娠4d的昆明小鼠胚胎,与MEFs共培养3-4d,能够获取分离培养类ES细胞的优质ICM；采用液氮反复冻融方法处理类ES细胞7次,能够获得物理方法冻融破坏比较完全的类ES细胞的无细胞裂解液；MEFs经TSA和5-Aza-dC预先处理,0.25·μL-1SLO渗透化处理后,与类ES细胞的无细胞裂解液共孵育,能够使MEFs发生逆转化,表现出多能干细胞的一些特征。试验表明：已经发生了终端分化的体细胞能够在类ES细胞裂解液活性物质的作用下发生逆转化,这种共孵育逆转化体细胞为干细胞的方法也会是一种不采用破坏胚胎途径产生自体干细胞的新途径。(本文来源于《西南大学》期刊2012-05-04）
小鼠胎儿成纤维细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为探究茶多酚(Tea polyphenols,TP)对体外培养鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibrolast,MEF)凋亡的影响。在MEF细胞培养液中添加质量浓度为0、10、40、70、100和150μg/mL的TP,分别培养24、48、72和96h,使用MTT法(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,噻唑蓝,MTT法)检测细胞活力;细胞培养72h,以RT-PCR检测B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B cell lymphoma leukemia-2,Bcl-2)、和Bcl相关的蛋白X(Bcl-as-sociated X protein,Bax)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)的相对表达量。MTT结果表明:TP质量浓度为40μg/mL时细胞密度略高于其他组,但是没有显着差异(P>0.05);质量浓度为100μg/mL时,对MEF的生长产生抑制作用(P<0.05),细胞形态没有发生明显变化;当质量浓度为150μg/mL时对细胞生长抑制作用明显(P<0.05),从形态观察细胞出现调亡;通过反转录结果表明,对Bax基因、Bcl-2基因和Caspase-3基因的分子转录水平没有影响(P>0.05),表明质量浓度高于100μg/mL TP对MEF生长产生抑制作用,但对Bax基因、Bcl-2基因和Caspase-3转录分子机制无影响。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
小鼠胎儿成纤维细胞论文参考文献
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[8].肖雄,赵海龙,邓玉金,邱小燕,王炜.不同浓度链球菌溶血素O对小鼠胎儿成纤维细胞生长状态的影响[J].中国畜牧杂志.2012
[9].何允.小鼠早期胚胎及胎儿成纤维细胞性别鉴定方法研究[D].西南大学.2012
[10].张翠平.诱导小鼠胎儿成纤维细胞为多能干细胞的共孵育方法研究[D].西南大学.2012
标签：小鼠; H2A.X; 卵母细胞裂解液; 胎儿成纤维细胞(MEFs);