AtGPRP3基因在拟南芥幼苗生长中的功能分析

论文摘要

广泛分布于植物中的GPRP（Glycine and proline-rich protein）蛋白家族基因已被报道在植物的生长发育过程中具有重要的作用。然而,目前很少见对植物中GPRP蛋白基因功能进行深入研究的报道。本研究以已报道的、尚未见生物学功能研究的拟南芥AtGPRP3基因为研究对象,在分析该基因基本特点、蛋白进化关系和表达特性的基础上,进一步创建了AtGPRP3基因的过量表达、CRISPR敲除缺失表达及其功能互补转基因材料,并对其在拟南芥幼苗生长发育过程中的作用进行了分析,初步发现AtGPRP3基因影响拟南芥幼苗的生长速率。为深入研究AtGPRP3基因的生物学功能奠定了基础。主要实验结果如下:1.拟南芥AtGPRP3基因的基本特点、蛋白进化关系和表达特征通过生物信息学分析发现,AtGPRP3基因包含2个外显子和1个内含子,共编码179个氨基酸,蛋白等电点（pI）为9.75,分子量（Mw）为17.8 kDa。蛋白进化分析结果表明,GPRP蛋白家族基因在单子叶和双子叶中不存在明显的分化。GUS染色和qRT-PCR结果显示,AtGPRP3基因主要在拟南芥的连座叶和茎上叶中的表达量较高,在成熟的果荚中表达较少。亚细胞定位结果表明,AtGPRP3蛋白主要在细胞核中表达。2.AtGPRP3的过量表达、缺失表达及其功能互补转基因拟南芥材料创建以pCXSN质粒构建了AtGPRP3的过量表达载体,利用Yao.ATU635s.HPT和pCAMBIA1300-Myc质粒分别构建了AtGPRP3的CRISPR敲除缺失表达突变体及其功能互补转基因遗传材料,目前已获得了AtGPRP3基因的过量表达、CRISPR敲除缺失表达及其功能互补转基因纯合株系各3种类型,用于后续的功能分析实验等。3.AtGPRP3影响拟南芥幼苗的生长发育分别在pH5.8和pH8.0两种培养基上种植野生型拟南芥、AtGPRP3基因的过量表达、缺失表达及其功能互补转基因拟南芥材料,对各种材料幼苗地上部鲜重进行统计分析结果显示:与野生型拟南芥幼苗地上部鲜重相比,AtGPRP3过量表达转基因植株幼苗地上部的鲜重显著减少,AtGPRP3缺失表达转基因植株幼苗的地上部鲜重显著增加,而功能互补转基因植株幼苗地上部鲜重与野生型的差异不显著。这些结果表明AtGPRP3对拟南芥幼苗地上部的鲜重可能具有负调控作用,进而影响拟南芥苗期的生长速率。4.AtGPRP3互作基因的筛选、鉴定与转基因功能验证在拟南芥幼苗cDNA酵母筛选文库构建和初筛的工作基础上,进一步开展了酵母双杂（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）实验鉴定等,共获得了3个AtGPRP3的互作基因AtCAT2、AtCLC3和AtCYSD1。进而利用CRISPR-Cas9技术,重点创建了互作基因AtCAT2的缺失表达拟南芥转基因突变体,并分别于pH5.8和pH8.0的两种培养基上种植生长,对其幼苗地上部鲜重进行统计分析结果表明:与野生型拟南芥幼苗地上部鲜重相比,AtCAT2的CRISPR敲除缺失表达突变体幼苗地上部鲜重显著降低。这一结果与AtGPRP3过量表达转基因株系的表型类似;由此,我们初步推测:AtGPRP3与AtCAT2结合对AtCAT2本身的作用可能具有抑制的效果,但有待进一步实验证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
•   1.1 植物生长发育的研究进展
•     1.1.1 光对植物生长发育的调控
•     1.1.2 激素对植物生长发育的影响
•     1.1.3 转录因子对植物生长发育的作用
•     1.1.4 其它因素对植物生长发育的影响
•   1.2 植物中GPRP蛋白基因家族的研究进展
•     1.2.1 植物中GPRP家族蛋白结构及表达特征
•     1.2.2 拟南芥GPRP基因家族的研究进展
•   1.3 拟南芥AtCAT2 基因的研究概述
•   1.4 本研究的内容、目的及意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验载体骨架
•     2.1.2 突变体和转基因材料
•     2.1.3 实验试剂与仪器耗材
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 生物信息学分析
•     2.2.2 实验载体的构建
•     2.2.3 核酸类实验
•     2.2.4 GUS染色
•     2.2.5 原生质体的制备与转化
•     2.2.6 亚细胞定位
• 2H）和双分子荧光互补（BiFC）'>    2.2.7 酵母双杂（Y₂H）和双分子荧光互补（BiFC）
•     2.2.8 拟南芥鲜重的统计
• 第3章 结果与分析
•   3.1 拟南芥AtGPRP3 基因的生物信息学分析
•     3.1.1 拟南芥AtGPRP3 基因的基本信息
•     3.1.2 拟南芥AtGPRP3 蛋白的系统进化树
•   3.2 拟南芥AtGPRP3基因的表达特性
•     3.2.1 AtGPRP3 基因不同组织部位的qRT-PCR
•     3.2.2 AtGPRP3 基因不同组织部位的GUS染色
•     3.2.3 AtGPRP3 蛋白的亚细胞定位
•   3.3 拟南芥AtGPRP3 实验材料的创建
•     3.3.1 缺失突变体的创建
•     3.3.2 拟南芥AtGPRP3 基因过表达及功能互补材料的创建
•   3.4 拟南芥AtGPRP3 影响拟南芥幼苗的生长发育
•     3.4.1 正常pH5.8 条件下AtGPRP3 基因对拟南芥鲜重的影响
•     3.4.2 碱性pH8.0 培养条件下AtGPRP3 对拟南芥幼苗鲜重的影响
•   3.5 AtGPRP3 的互作蛋白基因筛选、鉴定及功能分析
•     3.5.1 酵母双杂（Y2H）验证
•     3.5.2 双分子荧光互补（BiFC）验证
•     3.5.3 候选互作蛋白的亚细胞定位
•     3.5.4 拟南芥AtGPRP3 蛋白与AtCAT家族蛋白的互作验证
•     3.5.5 AtGPRP3 互作基因AtCAT2 的功能验证
• 第4章 讨论与展望
•   4.1 拟南芥AtGPRP3 基因的表达特性及亚细胞定位分析
•   4.2 拟南芥AtGPRP3 基因对拟南芥地上部分鲜重调控的分析
•   4.3 研究展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘晓京

导师: 李绍波

关键词: 幼苗鲜重,拟南芥,发育功能,生长速率

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

基金: 国家自然科学基金项目(31460279和31560298)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000511

总页数: 58

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