小麦转录因子TaC2H2ZF参与盐碱胁迫应答的功能研究

论文摘要

小麦是世界上种植面积最广和最重要的粮食作物之一,约有40%的人口依靠小麦提供营养。土壤盐渍化是一个日益严重且不可忽视的全球性问题,世界上约7%的陆地表面受到盐渍化的影响,对区域农业发展构成严重威胁。获取能耐受生物或非生物胁迫的可遗传的高产、优质小麦尤显重要。实验室前期通过以普通小麦济南177（Triticum aestivum L.,2n=6x=42,简称JN177）和长穗偃麦草（Thinopyrumponticum,2n=70）为亲本的不对称体细胞杂交技术,培育了一系列小麦渐渗系品种山融3号（Shanrong No.3,简称SR3）和山融4号（Shanrong No.4,简称SR4）等。已有研究显示这些品系都具有很强的盐碱耐受性。本研究通过第二代高通量测序技术,对经盐碱处理获得的SR4转录组进行分析,得到一个在盐碱胁迫下上调的小麦锌指蛋白基因TaC2H2ZF,该基因属于C2H2转录因子家族。利用农杆菌介导的拟南芥花序浸染法将TaC2H2ZF转化哥伦比亚生态型拟南芥（记为Col-0）中;获得了两个高效表达的拟南芥过表达系（分别记为OE1和OE2）。该基因具有如下特性:该TaC2H2ZF包含两个典型保守的锌指结构域和一个保守的EAR抑制结构域;在包括盐碱处理的非生物胁迫下出现不同的表达模式。洋葱表皮细胞瞬时表达亚细胞定位分析将TaC2H2ZF定位于细胞核中;经酵母单杂交系统验证该蛋白不具有体外转录激活活性,推测可能与EAR抑制结构域相关。1.TaC2H2ZF在拟南芥中的逆境胁迫应答在正常营养土壤中Col-0、OE1、OE2和拟南芥同源基因突变体（MU）的生长没有明显差异。而在200 mM NaCl和60 mM的溶液摩尔比为NaHC03:Na2C03=9:1的碱性盐溶液处理后的土壤中,Col-0、OE1、OE2及MU四个系的生长受抑制显著,但两个OE系长势明显好于Col-0和MU。在1/2MS培养基中的Col-0、OE和MU系生长没有明显不同,而在加入200 mM NaCl和2.0 mM NaHC03胁迫的1/2MS培养基中,两个拟南芥OE系地上部分生长明显茁壮,根系要长于Col-0和MU系植株,OE系表现出明显的抗盐碱性,该结果与土壤中的表型实验一致。在1.0 mM H202的氧化胁迫和200 mM甘露醇的渗透胁迫下,两个OE系的相对叶片面积显著高于Col-0和MU系,显示了它们对氧化胁迫与渗透胁迫的显著抗性。选取土壤实验中200 mM NaCl和碱性盐溶液处理的拟南芥叶片进行DAB和NBT染色,结果显示OE系受到ROS毒害的作用明显低于Col-0和MU,ROS清除酶活性也有显著提升。推测ROS信号通路可能在TaC2H2ZF介导的抗盐碱胁迫的机制中发挥重要作用。2.TaC2H2ZF在小麦逆境胁迫中的应答利用农杆菌介导的小麦生长点转化法,将TaC2H2ZF构建入实验室改造的适于在单子叶植物中表达的pGA3426-2T载体中,对普通小麦扬麦20进行基因转化。利用PCR进行T0代转基因苗的阳性检测。从1000棵左右转基因植株中得到58棵阳性植株,转化率约为5.8%。收获T0代种子132粒。通过温室加代并进行T1代植株的PCR阳性检测,得到12棵阳性植株,转化率为9%。对PCR检测为阳性的植株叶片进行qRT-PCR;同时对T1代阳性植株分别在两叶一心期进行盐（200 mM NaCl）胁迫处理和碱胁迫（80mM NaHC03:Na2CO3=9:1）处理。14 d后分别测定小麦叶片中脯氨酸、丙二醛、SOD、POD、CAT等理化指标。结果显示:经200 mM NaCl及碱性盐溶液处理,与对照相比,转TaC2H2ZF基因小麦中的pro、SOD、POD等氧化酶含量均有升高,且随着盐浓度升高转基因小麦的升高幅度更加明显。而转基因小麦与对照植株中MDA的含量均升高,随处理浓度的升高,转基因小麦叶片中MDA的含量低于对照。说明转TaC2H2ZF基因小麦在盐溶液处理和碱性盐溶液下的表达活性高于对照。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1. 植物转录因子研究
•     1.1 转录因子的结构
•     1.2 转录因子的功能
•     1.3 植物中其他主要的转录因子
•       1.3.1 bZIP家族
•       1.3.2 AP2/ERF超家族
•       1.3.3 MYB超家族
•       1.3.4 WRKY家族
•     1.4 植物C2H2型锌指蛋白转录因子的研究概述
•       1.4.1 锌指蛋白超家族
•       1.4.2 锌指蛋白的结构
•       1.4.3 锌指蛋白的生物学功能
•   2. 植物的耐逆性研究
•     2.1 植物耐盐性研究
•       2.1.1 种子萌发阶段对盐碱胁迫的响应
•       2.1.2 离子平衡对盐碱胁迫的响应
•       2.1.3 渗透调节对盐碱胁迫的响应
•       2.1.4 活性氧清除系统对盐碱胁迫的响应
•       2.1.5 植物内源激素对盐碱胁迫的响应
•     2.2 植物对氧化胁迫的响应
•       2.2.1 ROS的种类及危害
•       2.2.2 植物细胞ROS的产生
•       2.2.3 植物抗氧化机制
•     2.3 锌指蛋白的耐逆机制
•       2.3.1 锌指蛋白与植物的耐盐性
•       2.3.2 锌指蛋白与植物的其他耐逆性
•   3. 小麦的转基因研究
•     3.1 构建小麦转基因技术体系的必要性
•     3.2 小麦转基因技术研究进展
•       3.2.1 基因枪法
•       3.2.2 农杆菌转化法
•       3.2.3 花粉管通道法
•   4. 立题依据、研究目的与意义
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株与质粒
•     2.1.3 载体
•     2.1.4 主要酶、培养液与各种生化试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 基因的亚细胞定位
•     2.2.2 小麦的转化操作
•     2.2.3 突变体纯系鉴定
•     2.2.4 拟南芥过表达系的载体构建、筛选和获得
•     2.2.5 转基因拟南芥表型分析
•       2.2.5.1 培养皿培养法
•       2.2.5.2 萌发实验
•       2.2.5.3 营养土培养法
•     2.2.6 拟南芥Marker基因表达模式分析
•     2.2.7 ROS含量的测定
•     2.2.8 ROS清除酶活性测定
•   2.3 小麦的培养与处理
•     2.3.1 植物总RNA提取纯化与qRT-PCR
•     2.3.2 小麦的转基因处理
•     2.3.3 转基因小麦的筛选
• 第三章 小麦转录因子TaC2H2ZF在拟南芥中的功能探究
•   3.1 TaC2H2ZF的生物信息学分析
•   3.2 TaC2H2ZF基因克隆
•   3.3 TaC2H2ZF在小麦非生物胁迫中的表达模式分析
•   3.4 TaC2H2ZF体外转录激活活性的检测
•   3.5 TaC2H2ZF拟南芥转基因系的筛选
•     3.5.1 TaC2H2ZF的亚细胞定位
•     3.5.2 TaC2H2ZF异源表达拟南芥纯系的筛选
•     3.5.3 拟南芥AtC2H2ZF突变体的筛选
•   3.6 转TaC2H2ZF基因拟南芥功能分析
•     3.6.1 耐盐性分析
•     3.6.2 耐碱性分析
•     3.6.3 氧抗化胁迫分析
•     3.6.4 拟南芥ROS含量变化
•     3.6.5 拟南芥理化指标及分析
•     3.6.6 TaC2H2ZF影响了ROS的合成
•     3.6.7 TaC2H2ZF影响了有关离子转运载体基因
• 第四章 转基因小麦的功能探究
•   4.1 生长点法转化小麦
• 0代及T₁代转基因植株的检测'>  4.2 T₀代及T₁代转基因植株的检测
• 2代转基因小麦的耐盐碱性分析'>  4.3 T₂代转基因小麦的耐盐碱性分析
•     4.3.1 转基因小麦对盐碱胁迫的响应
• 2代转基因小麦生理指标测定'>    4.3.2 T₂代转基因小麦生理指标测定
• 第五章 讨论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王丽

导师: 王敏琴

关键词: 拟南芥,小麦,植物逆境胁迫,脯氨酸

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 山东大学

分类号: Q943.2;S512.1

总页数: 92

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