球孢白僵菌Endothiapepsin-like蛋白的毕赤酵母表达及酶活性的检测

论文摘要

Endothiapepsin蛋白是一种天冬氨酸蛋白水解酶,最初是从植物病菌丝状子囊菌栗疫菌（Endothia parasitic）分离鉴定的。然而在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）基因组中也存在着编码endothiapepsin-like蛋白的基因（BbeapA）,本实验室在前期关于不同致病性球孢白僵菌菌株在早期阶段侵染家蚕表皮比较转录组学的研究中发现endothiapepsin-like蛋白和其他一些天冬氨酸蛋白酶在高毒力菌株GXsk1011中是上调表达的,但是该蛋白在致病过程中的作用以及其他一些功能在球孢白僵菌中尚未有报道。本实验在前期将编码endothiapepsin-like蛋白的基因进行了克隆和测序的基础上,将其氨基酸序列与来源于栗疫菌的endothiapepsin（CAA37944）、球孢白僵菌Bb2860菌株的endothiapepsin-like（XP008601085）、家蚕的病原aspergillopepsin A-like天冬氨酸蛋白酶（XP022385274）和烟曲霉的aspergillopepsin F（XP753324）的氨基酸序列进行多重比对,发现球孢白僵菌GXsk1011菌株的endothiapepsin-like蛋白在其C端保守结构域处有一个氨基酸发生了突变,即由Ser/Thr变为Gly,故是否是因为保守区存在氨基酸的突变才将其命名为endothiapepsin-like蛋白呢?问题的关键是这种突变对endothiapepsin-like蛋白的活性是否有影响,该蛋白在侵染家蚕过程中发挥了怎样的作用都是未知的。因此,本实验将球孢白僵菌GXsk1011菌株的endothiapepsin-like蛋白通过毕赤酵母表达系统进行了真核表达,并进行了重组蛋白的酶活性检测,本文的主要研究结果如下:1.BbeapA基因的克隆（无信号肽）及其生物信息学分析提取球孢白僵菌GXsk1011菌株的RNA,反转录成cDNA,根据毕赤酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA的多克隆位点设计引物,以该cDNA为模板克隆无信号肽的BbeapA基因并对其做进一步生物信息学分析。通过多重序列比对发现endothiapepsin-like蛋白的C端保守结构域位点的一个Ser/Thr突变为Gly;通过软件对该蛋白在线预测其分子量大小为40 kD;N-糖基化位点预测发现该蛋白在第134个氨基酸处具有糖基化位点;三维结构预测发现该蛋白在89和276位处具有天冬氨酸残基催化位点。2.重组Endothiapepsin-like蛋白在毕赤酵母中的表达将克隆的无信号肽的BbeapA基因分别与毕赤酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA连接,转化至毕赤酵母感受态细胞GS115中,构建重组酵母菌株GS115/pPIC9K-BbeapA和GS115/pPICZαA-BbeapA。对该重组菌株用甲醇作为唯一碳源诱导发酵,将发酵上清进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果显示和对照菌株相比,两种重组菌株均在40 kDa和45 kDa出现了两条明显的条带,且无明显差异,因此选用重组菌株GS115/pPIC9K-BbeapA进行后续实验。将重组菌株GS115/pPIC9K-BbeapA用甲醇诱导发酵120 h后,发酵上清用硫酸铵盐析沉淀并进行Western blotting验证和Ni-NTA亲和层析,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示依然出现了两条带,一条带在40 kD处,另一条在45 kD处;在发酵初期45 kD处的条带比较明显,40 kD处的条带的亮度比较暗,而在发酵后期则40 kD处的条带比较明显,45 kD处的条带会越来越弱直至消失。因此推测45 kD处的条带可能为目的蛋白被糖基化所致,而40 kD处的条带可能是目的蛋白的糖基化链断裂所致,因此推测两条带均为目标蛋白。3.重组Endothiapepsin-like蛋白酶活性的检测对纯化的重组endothiapepsin-like蛋白进行酶活性的测定,首先以酪蛋白为底物检测其活性,当温度为40℃,pH为4.0时重组endothiapepsin-like蛋白的活力达到83.55 U/mg。其次以家蚕表皮作为底物检测重组endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁蛋白质的降解能力,发现重组endothiapepsin-like蛋白作用家蚕表皮时对表皮蛋白的释放能力比对照磷酸缓冲液（PBS）提高了的1.4倍（P<0.01）,定量SDS-PAGE电泳检测显示endothiapepsin-like蛋白作用家蚕表皮后发挥了明显的降解作用,在10 kD以下的位置明显聚集了很多小分子蛋白。扫描电镜对家蚕体壁结构进一步分析显示重组endothiapepsin-like蛋白处理的家蚕体壁其表皮沟壑比PBS对照组要深,表面更加清洁光滑。结果表明:球孢白僵菌endothiapepsin-like蛋白仍然具有很强的酶活性,对家蚕体壁可发挥降解作用并可能参与了家蚕表皮的侵染过程,结合本实验室前期对该基因的敲除以及功能验证,表明该蛋白酶也是球孢白僵菌一种重要的毒力因子。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章文献综述

1.1 球孢白僵菌的简介

1.1.1 球孢白僵菌的生物学特性

1.1.2 球孢白僵菌的应用

1.1.3 球孢白僵菌的致病机理

1.2 球孢白僵菌蛋白酶的研究简介

1.2.1 蛋白酶在球孢白僵菌侵染过程中的作用

1.2.2 天冬氨酸蛋白酶概述

1.2.3 Endothiapepsin蛋白概述

1.3 巴斯德毕赤酵母表达系统

1.3.1 巴斯德毕赤酵母表达系统简介

1.3.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的组成

1.3.3 影响外源蛋白表达的因素

第2章引言

2.1 研究背景和意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

第3章 BbeapA基因（无信号肽）的克隆及生物信息学分析

3.1 实验材料

3.1.1 实验菌株与载体

3.1.2 实验试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 实验方法

3.2.1 球孢白僵菌GXsk1011 的培养

3.2.2 球孢白僵菌GXsk1011 RNA的提取

3.2.3 RNA反转录c DNA第一链的合成

3.2.4 目的基因的克隆

3.2.5 生物信息学分析

3.3 结果分析

3.3.1 BbeapA基因（无信号肽）的克隆

3.3.2 阳性克隆的初步筛选及测序验证

3.3.3 生物信息学分析

3.4 小结与讨论

第4章重组Endothiapepsin-like蛋白在毕赤酵母中表达

4.1 实验材料

4.1.1 菌株与载体

4.1.2 实验试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 实验方法

4.2.1 质粒的提取

4.2.2 基因BbeapA与 pPIC9K、pPICZαA载体的酶切和连接

4.2.3 连接产物转化大肠杆菌DH5α

4.2.4 阳性克隆的筛选与鉴定

4.2.5 质粒的提取及线性化

4.2.6 毕赤酵母感受态细胞的制备

4.2.7 电穿孔转化GS

4.2.8 转化子的筛选鉴定

4.2.9 高表达菌株的筛选

4.2.10 高表达菌株的鉴定

4.2.11 Endothiapepsin-like蛋白在毕赤酵母中的表达

4.2.12 发酵上清蛋白电泳及检测

4.2.13 Western Blotting检测

4.2.14 Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白

4.3 结果分析

4.3.1 表达质粒的构建和验证

4.3.2 重组酵母菌株的构建与筛选

4.3.3 高拷贝菌株的筛选

4.3.4 阳性克隆测序鉴定

4.3.5 发酵上清SDS-PAGE检测

4.3.6 发酵时间的确定

4.3.7 Western Blotting的检测

4.3.8 Ni-NTA纯化目的蛋白

4.4 小结与讨论

第5章重组Endothiapepsin-like蛋白的活性检测

5.1 实验材料

5.1.1 试验昆虫

5.1.2 实验试剂

5.1.3 主要仪器

5.2 实验方法

5.2.1 天冬氨酸蛋白酶活力的测定

5.2.2 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁蛋白质的降解

5.2.3 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕表皮降解的扫描电镜观察

5.3 结果分析

5.3.1 天冬氨酸蛋白酶活性的测定

5.3.2 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁蛋白质的降解

5.3.3 重组Endothiapepsin-like蛋白对家蚕体壁降解的扫描电镜观察

5.4 小结与讨论

第6章全文总结

参考文献

致谢

发表论文及参加的科研项目

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张宝玲

导师: 万永继

关键词: 球孢白僵菌,蛋白,毕赤酵母,真核表达,酶活性

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

分类号: Q933

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球孢白僵菌Endothiapepsin-like蛋白的毕赤酵母表达及酶活性的检测

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