TNRC6对哺乳动物细胞中RNA干扰和基因表达调控的影响

论文摘要

GW182又名TNRC6A,是RNA干扰过程中的核心蛋白,其与TNRC6B和TNRC6C为同源蛋白。已有研究表明,GW182可以作为骨架蛋白与AGO2（argonaute 2）及其他RNA干扰蛋白整合在一起并形成更大的蛋白复合体。但是,一直以来,研究人员大都致力于研究AGO2在细胞内的生物学作用,而对于TNRC6A,甚至TNRC6蛋白家族在细胞中的具体作用并没有深入的研究和了解。鉴于此,本研究利用小RNA在哺乳动物细胞系中对TNRC6家族基因进行了敲低和敲除,并对其生物学活性进行了研究。本研究详细阐述了TNRC6蛋白家族在RNA干扰过程中的作用。首先利用siRNA在不同的细胞系中敲低了TNRC6蛋白的表达,并检测了其对小RNA在细胞内源基因表达调控中的不同影响,包括小RNA介导的转录水平激活、转录水平抑制、可变剪接的影响以及miRNA介导的基因沉默等。本研究发现,在这些不同的生物学过程中,只有AGO2是必不可少的,GW182/TNRC6A只参与了其中一部分生物学过程。此外,本研究利用CRISPR/Cas9技术得到了TNRC6A、TNRC6B和TNRC6AB等基因敲除细胞系,并利用蛋白质谱、RNA测序等多种手段比较鉴定了不同基因敲除细胞系中差异基因及蛋白的表达,同时利用以上几种基因敲除细胞系,较为系统的检测了TNRC6蛋白在小RNA介导生物过程中的作用。本研究主要结果如下:（1）通过siRNA成功在多个哺乳动物细胞系中敲低了TNRC6基因表达,并检测了其生物学作用。研究发现,在miRNA介导的基因表达沉默、小RNA介导的转录水平激活、转录水平抑制和可变剪接等生物过程中,TNRC6蛋白参与了siRNA介导的转录水平激活基因表达和miRNA介导的基因沉默的部分过程。与之相比,AGO2在这些小RNA介导的基因表达调控中的作用更为重要。（2）利用CRISPR/Cas9技术,成功获得TNRC6A单基因敲除细胞系,TNRC6B单基因敲除细胞系和TNRC6AB双基因敲除细胞系。在多次尝试TNRC6蛋白家族（TNRC6ABC）三基因敲除失败后,本研究发现TNRC6AB双基因敲除已经影响细胞的正常生长,因此认定TNRC6A、TNRC6B和TNRC6C中至少有一个基因是维持细胞生长所必需的。所以本研究在TNRC6AB双基因敲除的基础上再次利用siRNA敲低TNRC6C的表达,以研TNRC6家族在细胞中的功能。并且在获得敲除细胞系后,利用蛋白质谱和qRT-PCR分别在蛋白和mRNA水平对目的基因进行了检测,确定了目的基因的成功敲除。此外,本研究还通过免疫荧光对TNRC6A和AGO2在HCT116野生型和基因敲除型细胞中的表达进行了检测,进一步确定基因的成功敲除。（3）利用以上基因敲除型细胞系,本研究对TNRC6影响RNA干扰因子在细胞胞质和细胞核内分布的作用进行了验证,结果表明TNRC6蛋白只影响Dicer蛋白在细胞中的亚定位,对AGO2的分布没有直接的影响。此后检测了TNRC6在siRNA介导的胞质内mRNA的降解和细胞核内长链非编码RNA的降解中的作用,阐述了其在miRNA介导的基因沉默以及小RNA介导的转录水平激活过程中的影响。研究结果表明TNRC6并不直接作用于siRNA介导的基因沉默,却在miRNA通路中具有非常重要的作用,并且其蛋白家族之间的作用是互补的。仅缺失TNRC6A或TNRC6B并不会影响miRNA通路的正常功能,同时缺失TNRC6A和TNRC6B对其有一定的影响,当对TNRC6AB双基因敲除细胞系的TNRC6C进行敲低表达后,miR-34a在细胞中无活性,证明了TNRC6蛋白家族在miRNA通路中的重要作用。此外,只有TNRC6A参与了siRNA介导的基因转录,而TNRC6B和TNRC6C对该过程没有显著影响。（4）利用RNA-seq对不同基因敲除细胞系进行了基因差异表达分析。与野生型细胞HCT116相比,在TNRC6A-/-细胞中,显著上调的基因有1447个,并且上调基因主要富集分析中主要富集在细胞分化、形态、生长及蛋白定位等信号通路上,显著下调的基因有1190个;TNRC6AB-/-细胞中,有2710个基因显著性上调,有2750个显著性下调,并且大量上调基因主要富集在细胞分化、形态、生长及蛋白定位等信号通路上,下调基因主要富集在核糖体RNA、核糖体相关、线粒体相关的信号通路上;而在TNRC6B-/-细胞中上调基因仅有270个,下调基因仅有156个。结果表明TNRC6B对细胞中基因表达的影响较小,而TNRC6A的作用则非常重要,但两者具有相辅相成的作用效果。综上所述,TNRC6在细胞的多个生物学过程中发挥着重要的作用。TNRC6参与了miRNA介导的基因表达沉默并且在该过程中起到决定性作用,该基因也参与了基因转录激活的部分过程。并且,本研究在多个层次对该基因以上功能进行了验证,并通过RNA测序手段进一步证明了该基因在细胞生长过程中的重要性,为后期对TNRC6基因在动物细胞水平中的作用奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号对照表
• 第一章 文献综述
•   1.1 Ago2和TNRC6蛋白家族
•     1.1.1 Ago2蛋白的功能及作用
•     1.1.2 TNRC6蛋白家族的功能及作用
•     1.1.3 小结
•   1.2 RNA干扰
•     1.2.1 RNAi简介
•     1.2.2 非哺乳动物系统细胞核RNAi
•     1.2.3 哺乳动物细胞核内RNAi
•     1.2.4 RNA介导的转录调控
•     1.2.5 小结
•   1.3 CRISPR/Cas系统
•     1.3.1 CRISPR系统的发展
•     1.3.2 CRISPR系统的应用
•     1.3.3 小结
•   1.4 蛋白质谱
•     1.4.1 凝胶消化法
•     1.4.2 溶液消化法
•     1.4.3 蛋白含量的计算方法
•   1.5 RNA-seq
•   1.6 本研究的意义
• 第二章 敲低TNRC6对不同RNA干扰的影响
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 细胞系
•     2.1.2 主要试剂及其配制
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 小RNAs及序列
•     2.1.5 引物及序列
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 不同细胞系转染
•     2.2.2 实时荧光定量检测siRNAs的工作效率
•     2.2.3 Western blot检测ATX3、PR和COX2蛋白表达量
•     2.2.4 凝胶电泳检测Luciferase可变剪接
•     2.2.5 蛋白质谱定量
•   2.3 试验结果
•     2.3.1 siRNA的效率
•     2.3.2 TNRC6在调控ATX-3基因中的作用
•     2.3.3 TNRC6在miR-34a中的作用
•     2.3.4 TNRC6在调控基因可变剪接中的作用
•     2.3.5 TNRC6在调控PR基因中的作用
•     2.3.6 TNRC6在调控COX-2基因中的作用
•     2.3.7 TNRC6在细胞中的相对定量
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 TNRC6敲除细胞系的建立及鉴定
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 细胞系
•     3.1.2 主要试剂材料及其配制
•     3.1.3 引物和序列
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 sgRNA的设计及筛选
•     3.2.2 敲除细胞系的鉴定
•     3.2.3 敲除细胞系的qPCR检测基因表达水平
•     3.2.4 敲除细胞系的蛋白鉴定
•     3.2.5 敲除细胞系的生长速度检测
•     3.2.6 敲除细胞系的免疫荧光检测
•   3.3 试验结果
•     3.3.1 sgRNA的效率检测
•     3.3.2 基因敲除系的鉴定
•     3.3.3 Western Blot检测基因敲除细胞系中TNRC6A蛋白的表达量
•     3.3.4 敲除细胞系的蛋白质谱鉴定
•     3.3.5 敲除细胞系的qPCR检测
•     3.3.6 敲除细胞系的免疫荧光检测
•     3.3.7 敲除细胞系的生长曲线
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 在TNRC6基因敲除细胞系中验证TNRC6基因的功能
•   4.1 试验材料
•     4.1.1 细胞系
•     4.1.2 主要试剂材料及其配制
•     4.1.3 siRNA和序列
•     4.1.4 qPCR引物及序列
•   4.2 试验方法
•     4.2.1 不同细胞系转染
•     4.2.2 样品RNA提取及mRNA水平检测
•     4.2.3 细胞全蛋白提取及western检测
•     4.2.4 细胞胞质蛋白及细胞核蛋白的提取及鉴定
•   4.3 试验结果
•     4.3.1 siTNRC6C在 HCT116野生型和TNRC6AB-/-细胞系中的效率鉴定
•     4.3.2 TNRC6的敲除对细胞RNA干扰因子细胞内定位的影响
•     4.3.3 小RNA介导的基因沉默中TNRC6不是必须的
•     4.3.4 TNRC6在激活COX-2基因中的作用
•     4.3.5 TNRC6在miRNA通路中的必要性
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 TNRC6敲除系的RNA测序
•   5.1 试验材料
•     5.1.1 细胞系
•     5.1.2 主要试剂材料及其配制
•   5.2 试验方法
•     5.2.1 RNA的提取
•     5.2.2 RNA样品的浓度及RIN检测
•     5.2.3 RNA-seq的进行
•     5.2.4 RNA-seq结果的分析
•   5.3 试验结果
•     5.3.1 RNA样品的浓度及RIN测定
•     5.3.2 敲除细胞系基因表达谱的比较分析
•     5.3.3 WT和TNRC6A-/-细胞系间的差异性表达分析
•     5.3.4 WT和TNRC6B-/-细胞系间的差异性表达分析
•     5.3.5 WT和TNRC6AB-/-细胞系间的差异性表达分析
•     5.3.6 敲除细胞系差异表达分析及GO富集分析
•   5.4 讨论
•   5.5 小结
• 结论与创新点
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘中天

导师: 张智英,David R.Corey

关键词: 干扰,蛋白质谱,细胞核,细胞质蛋白定位,测序

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家科技重大专项转基因生物新品种培育专项基金(编号:2018ZX08010-09B)

分类号: Q953

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000100

总页数: 120

文件大小: 8138K

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