HIF1α上调Runx2促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化与血管形成机制研究

论文摘要

目的:间充质干细胞（mesenchymal Stem Cells,MSCs）在骨折后骨修复过程中具有重要作用,骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导的MSCs骨再生过程中,组织缺氧是血管生成的关键驱动力;团队前期工作发现,关键分子缺氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α）与Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）之间存在一定调控关系,但BMP9诱导的MSCs促进骨生成与血管形成偶联效应机制是否通过HIF1α与Runx2之间调节仍不清楚。因此,明确HIF1α与Runx2调控促进BMP9诱导干细胞成骨与成血管的机制,以促进BMP9骨再生效果,为临床治疗骨缺损或骨不连提供新的思路。方法:（1）提取小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEFs）细胞,流式细胞鉴定间充质干细胞表型,分别使用成骨、成软骨和成脂细胞诱导培养基诱导培养MEFs,在7d和21d时分别使用茜素红染色检测成骨,甲苯胺蓝染色检测成软骨及油红O染色法检测成脂能力。通过构建重组腺病毒外源性过表达Ad-BMP9,Ad-HIF1α与Ad-Runx2,沉默Ad-simHIF1α与Ad-simRunx2,转染调控MEFs,通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色分析早期成骨能力,茜素红染色分析晚期骨矿化能力,实时荧光定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR）与蛋白免疫印迹实验（Western Blot）检测成骨与成血管标志物,细胞免疫组化分析成血管标志物,体外探索基于BMP9诱导的MSCs分化过程中,HIF1α与Runx2之间相互调控的作用。（2）使用裸鼠体内异位骨化模型,将外源性过表达或沉默的HIF1α与Runx2转染BMP9诱导MEFs细胞并注入裸鼠皮下,通过Micro CT分析骨量,H&E染色检测成骨分化与血管管腔的数量,Masson’s Trichrome染色显示小梁骨分布情况,骨组织切片行免疫组化染色检测成骨与成血管相关标志物的表达和分布,验证HIF1α与Runx2相互调控促进BMP9诱导MSCs骨生成与血管形成作用。（3）构建了过表达BMP9、HIF1α与Runx2的质粒,通过使用双荧光素酶报告基因试验,探索HIF1α与Runx2分子互相之间对其启动子的作用;应用染色质免疫共沉淀试验检测HIF1α与Runx2是否存在天然染色质和蛋白质结合情况,蛋白免疫印迹试验（Western Blot）检测HIF1α与Runx2对BMP经典Smads依赖通路与非经典MAPK通路关键因子的影响,探讨HIF1α与Runx2之间调控促进BMP9诱导成骨分化与血管生成可能机制。结果:（1）MEFs作为来源于胚胎的间充质干细胞,是一种具有自我更新和复制能力的多能干细胞,MEFs细胞可以向成骨、成软骨及成脂肪细胞等中胚层组织分化的能力,在培养过程中具备较好的细胞增殖与细胞形态维持能力;（2）通过转染重组腺病毒后,外源性过表达Ad-BMP9,Ad-HIF1α与Ad-Runx2,沉默Ad-simHIF1α与Ad-simRunx2,调控BMP9诱导的MEFs,重组腺病毒转染MSCs后荧光表达持续、有效,BMP9转染C3H10T1/2,iMADs及MEFs不同的MSCs后,qRT-PCR比较目的基因HIF1α与Runx2表达量,在MEFs组相对更持久;（3）HIF1α促进BMP9诱导MEFs成骨过程中,早期成骨分化加速,晚期骨矿化与钙盐沉积增加,qRT-PCR检测成骨相关标志物ALP、BSP、OCN、OPN、COL-A1及OSX的mRNA表达量随诱导时间的延长,表达上调（P<0.05）,而外源性应用沉默HIF1α后导致该成骨效果显著下降（P<0.05）;Runx2促进BMP9诱导MSC早期成骨分化,维持晚期骨矿化与钙盐沉积,qRT-PCR检测成骨相关标志物,在第3d时,实验各组中ALP的mRNA表达水平均有显著上调（P<0.05）,在第5d时,实验各组中OCN和COL-A1的表达量均有显著性上升（P<0.05）,在第7d时,实验各组中OCN、OPN、COL-A1及OSX的mRNA表达水平显著性上调（P<0.05）。当外源性应用沉默HIF1α和Runx2基因后,上述成骨相关基因的mRNA表达显著下降（P<0.05）,比较Ad-BMP9+Ad-simRunx2组,Ad-BMP9+simHIF1α组,在第7d时,成骨标志物ALP、BSP、OCN、OPN、COL-A1及OSX的基因表达水平有显著下调（P<0.05）。Western Blot检测晚期成骨指标OPN、OCN蛋白发现在第7天时,OPN与OCN的蛋白表达水平在Ad-BMP9+Ad-HIF1α组中,较其他组有显著上调,差异具有统计学意义（P<0.05）;（4）HIF1α与Runx2增强BMP9诱导MSCs体外成血管分化,HIF1α促进BMP9诱导MEFs成血管过程中,成血管相关标志物CD31、VEGF与SLIT3的mRNA表达水平显著性升高（P<0.05）,Runx2可显著促进BMP9诱导的血管生成标志物VEGF的表达水平增高（P<0.05）,细胞免疫组化染色结果显示HIF1α与Runx2能增强BMP9诱导MEFs细胞VEGF表达量,但分别转染Ad-simHIF1α与Ad-simRunx2后,VEGF表达水平显著下调,在此过程中,对比Ad-BMP9+Ad-sim Runx2组,Ad-BMP9+Ad-simHIF1α组中,对MEFs有着更显著的抑制血管生成的作用,其差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）将外源性过表达或沉默的HIF1α与Runx2重组腺病毒转染BMP9诱导的MEFs细胞,24h后注入裸鼠皮下,Micro CT扫描结果显示Ad-BMP9+Ad-HIF1α组中在骨量、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨密度等参数均有显著升高（P<0.05）,组织切片Masson’s Trichrome染色结果可见大量小梁骨生成,小梁骨网状排列,H&E切片染色结果可见细胞间血管管腔数量增加,同时免疫组化染色结果显示VEGF与vWF成血管因子表达增加。但在沉默HIF1α基因后,可明显抑制BMP9诱导的MEFs成骨与成血管效应,且抑制效应高于沉默Runx2基因。外源性过表达Runx2没有明显增强体内成骨的作用,但Micro CT扫描结果显示Ad-BMP9+Ad-simHIF1α组在骨量、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨密度等均有显著的下降（P<0.05）,Masson’s Trichrome染色结果可见小梁骨减少,H&E染色结果可见细胞间血管的管腔数量减少,同时免疫组化染色结果发现VEGF与vWF成血管因子表达量有不同程度的减少。（6）HIF1α可调节经BMP9诱导的MEFs内Runx2的启动和转录过程,通过双荧光素酶基因报告实验检测两者启动子的活性,基因报告实验结果显示HIF1α在基因转录层面,能够调控Runx2的启动与激活。染色质免疫共沉淀实验结果显示BMP9诱导的MEFs内,HIF1α通过结合Runx2外显子前方-250-700bp的DNA片段,调节Runx2启动转录。Western Blot检测结果发现HIF1α可以调控BMP9诱导的MEFs中Smad1/5/8、Erk1/2、p38及JNK的磷酸化。而Runx2的水平改变可以Erk1/2的磷酸化与蛋白总量水平。结论:（1）小鼠胚胎成纤维细胞具有MSCs的特征并且可以向成骨细胞,软骨细胞及脂肪细胞的潜能,可选作为骨组织工程学的种子细胞;（2）HIF1α可通过蛋白质与染色质的直接结合作用,发挥上调Runx2促进BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化与血管形成,为临床治疗骨缺损或骨不连提供新的思路。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
•   参考文献
• 第一部分 HIF1α与Runx2 之间调控BMP9 诱导MSCs成骨与成血管体外效应研究
•   1 实验材料
•   2 实验方法
•   3 结果
•   4 讨论
•   5 小结
•   参考文献
• 第二部分 体内验证HIF1α与Runx2 调控BMP9 诱导的成骨与成血管的作用
•   1 实验材料
•   2 实验方法
•   3 结果
•   4 讨论
•   5 小结
•   参考文献
• 第三部分 初步探寻转录层面HIF1α与Runx2 相互调控BMP9 诱导的MSC成骨分化与血管形成机制
•   1 实验材料
•   2 实验方法
•   3 结果
•   4 讨论
•   5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述：BMP与 HIF信号通路在成骨与成血管的方面进展研究
•   参考文献
• 致谢
• 博士期间的主要学术成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘子铭

导师: 黄伟

关键词: 骨形态发生蛋白,缺氧诱导因子,间充质干细胞,成骨分化,血管形成

来源: 重庆医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 重庆医科大学

分类号: R329.2

总页数: 122

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