鱼类特有的蛋白激酶Z（PKZ）启动先天免疫反应的研究

论文摘要

蛋白激酶Z（PKZ）是一个近年来在鱼类报道的eIF2α激酶家族新成员,因此对它的功能研究并不多见。现在认为PKZ为鱼类特有的蛋白激酶,它能够结合并磷酸化eIF2α,最终诱导细胞凋亡。另外PKZ能响应多种病原体的感染并上调表达,但是对于其具体涉及的抗病毒信号通路还不清楚。在本研究中,草鱼PKZ为本课题的研究对象。草鱼PKZ蛋白由C端的eIF2α激酶催化结构域和N端的2个Z-DNA结合结构域组成。研究发现:在B-DNA和Z-DNA的刺激下,PKZ及先天免疫通路中的信号分子（IRF3,STING,ZDHHC1,IPS-1,TBK1和IFN）在mRNA水平都发生显著的上调,并且PKZ上调表达的时间都比较早,说明其发挥功能在感染早期。亚细胞定位分析表明PKZ定位于细胞质中,这也就为其在胞质中识别外源核酸提供了可能。DNA-pulldown实验证实PKZ更偏好结合DNA分子,而不结合RNA分子,而且PKZ的N端Z-DNA结构域能结合DNA分子,而C端的eIF2α激酶区却不能,表明N端的Z-DNA结构域是其结合DNA分子活性区。我们从mRNA、蛋白质、启动子活性水平均证实了PKZ能够启动Ⅰ型干扰素的表达。说明PKZ能够启动先天免疫反应。免疫共沉淀实验发现PKZ能够与IRF3信号通路中的IRF3,STING,ZDHHC1及ISGF3-like信号通路中的IRF9和STAT2发生相互作用。实验证明PKZ能够激活IRF3和STAT2的活性。这些结果说明PKZ是通过IRF3和ISGF3依赖的信号通路实现信号传递。为了深入研究PKZ分别与IRF3、ISGF3-like依赖信号通路的关系,我们发现如果敲降PKZ对IRF3及ISGF3-like信号通路产生了明显抑制作用,同样,敲降IRF3和IRF9,对PKZ的传递信号也产生明显的抑制效果,这就说明PKZ与IRF3和ISGF3-like信号通路是相互依存关系。表明PKZ能作为鱼类当中特有DNA识别受体,并且通过IRF3和ISGF3-like依赖的信号通路启动Ⅰ型干扰素的表达。另外,本研究深入探索草鱼IRF3依赖的信号通路。通过文献查阅发现两个与DNA病毒诱导相关蛋白ZDHHC1、STING在其中起重要的作用。首先通过同源克隆获得了草鱼ZDHHC1和STING的全长cDNA序列,然后对STING和ZDHHC1的细胞定位进行了分析。发现STING与ZDHHC1都定位于内质网上,这就说明它们可能具有一定的功能联系。ZDHHC1及STING能响应B-DNA和Z-DNA的刺激并上调表达;通过检测Ⅰ型干扰素的mRNA、蛋白质、启动子活性水平表明:在CIK细胞中过表达STING和ZDHHC1能够激活Ⅰ型干扰素的表达,反之敲降STING或者ZDHHC1显著抑制了Ⅰ干扰素的表达。为了探索STING和ZDHHC1上调Ⅰ型干扰素表达的机制,我们开展了免疫共沉淀、免疫荧光、GST-pulldown和双分子荧光互补实验,结果表明STING和ZDHHC1能分别于IRF3发生相互作用,并且STING能与ZDHHC1发生直接的相互作用。这也就说明STING首先与ZDHHC1形成二聚体后然后招募IRF3。随后的激活实验表明STING与ZDHHC1能促进IRF3发生二聚化及核转位。结果证明了鱼类STING与ZDHHC1在DNA病原核酸刺激时,在内质网上形成二聚体,随后招募IRF3,并促使它激活进入核内启动Ⅰ型干扰素的表达。本文第三部分对鱼类IRF3的自调控进行了分析,发现IRF3在众多干扰素调控因子中起主导地位。首先通过tail-PCR技术克隆了草鱼IRF2、IRF3的启动子序列,并将它们与实验室前期克隆获得的草鱼IRF1和IRF7启动子进行元件分析,结果发现在这些启动子上都发现了IRF-E元件。启动子亲和分析实验表明草鱼IRF3原核蛋白能够与IRF1、IRF2、IRF3、IRF7启动子发生结合。随后在mRNA及启动子活性水平证明IRF3能够上调IRF1、IRF2、IRF3及IRF7的转录水平。这些结果表明草鱼IRF3不仅能调控Ⅰ型干扰素及ISG基因的表达,而且它还能调控IRF1、IRF2、IRF3、IRF7的表达从而影响控制整个先天免疫强度。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1.1 先天免疫简介
•   1.2 模式识别受体及其介导的信号通路
•     1.2.1 RLR介导的信号通路
•     1.2.2 TLR介导的信号通路
•     1.2.3 NLR介导的信号通路
•     1.2.4 胞浆DNA模式受体介导的信号通路
•   1.3 IRF3依赖的信号通路
•   1.4 ISGF3依赖的信号通路
•   1.5 PKZ
•     1.5.1 PKZ的发现史
•     1.5.2 PKZ的结构特点
•     1.5.3 PKZ的研究进展
•   1.6 本研究的目的及意义
• 第二章 实验材料
•   2.1 仪器与试剂
•     2.1.1 主要仪器
•     2.1.2 主要试剂、耗材和试剂盒
•     2.1.3 载体、菌种、细胞系和草鱼
•     2.1.4 引物及si RNA合成序列表
•   2.2 相关软件及网址
• 第三章 DNA介导下,PKZ启动先天免疫反应的研究
•   3.1 实验方法
•     3.1.1 细胞培养与转染
•     3.1.2 双链寡聚核苷酸的形成
•     3.1.3 表达载体的构建
•     3.1.4 B-DNA和Z-DNA刺激下,PKZ与先天免疫信号分子的细胞表达
•     3.1.5 PKZ的亚细胞定位分析
•     3.1.6 PKZ与寡聚核苷酸的亲和分析
•     3.1.7 B-DNA和Z-DNA对PKZ活性的影响
•     3.1.8 过表达PKZ对IFN表达的影响
•     3.1.9 PKZ启动先天免疫反应的活性区
•     3.1.10 PKZ与先天免疫信号分子的互作分析
•     3.1.11 PKZ对IRF3及ISGF3-like依赖信号通路的影响
•     3.1.12 敲降PKZ对IRF3及ISGF3-like依赖信号通路的影响
•     3.1.13 敲降IRF3或IRF9对PKZ启动IFN表达影响
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 PKZ与先天免疫信号通路信号分子响应DNA诱导上调
•     3.2.2 PKZ的亚细胞定位
•     3.2.3 PKZ特异性结合DNA
•     3.2.4 B-DNA和Z-DNA激活PKZ活性
•     3.2.5 PKZ启动IFN的表达
•     3.2.6 PKZ与IRF3及ISGF3-like依赖的信号分子发生相互作用
•     3.2.7 PKZ通过IRF3及ISGF3-like依赖的信号通路进行信号传递
•     3.2.8 DNA诱导下,由PKZ启动的先天免疫信号通路图
•   3.3 讨论
• 第四章 ZDHHC1与STING作为IRF3的共激活因子
•   4.1 实验方法
•     4.1.1 Ci ZDHHC1全长c DNA的克隆及系统进化分析
•     4.1.2 原核蛋白的表达和纯化
•     4.1.3 Ci ZDHHC1兔多抗血清的制备
•     4.1.4 荧光定量PCR分析ZDHHC1与STING在组织和细胞中的表达
•     4.1.5 ZDHHC1与STING的亚细胞定位
•     4.1.6 过表达ZDHHC1与STING对IFN启动子活性影响
•     4.1.7 过表达ZDHHC1与STING对IFN蛋白水平的影响
•     4.1.8 敲降ZDHHC1和STING对IFN表达的影响
•     4.1.9 敲降IRF3后对STING/ZDHHC1依赖通路的影响
•     4.1.10 IRF3分别与STING、ZDHHC1的关系
•     4.1.11 ZDHHC1与STING之间的关系
•     4.1.12 ZDHHC1和STING对IRF3活性的影响
•   4.2 结果分析
•     4.2.1 草鱼ZDHHC1全长CDNA的克隆及进化分析
•     4.2.2 Western Blot检测草鱼ZDHHC1多抗血清的特异性
•     4.2.3 ZDHHC1与STING基因的表达
•     4.2.4 ZDHHC1与STING的亚细胞定位
•     4.2.5 ZDHHC1和STING通过IRF3信号通路激活IFN的表达
•     4.2.6 草鱼ZDHHC1与STING之间的关系
•     4.2.7 ZDHHC1和STING激活IRF3活性（核转位、二聚化）
•   4.3 讨论
• 第五章 鱼类IRF3自调控及反馈激活机制的研究
•   5.1 实验方法
•     5.1.1 启动子的克隆及结合元件预测
•     5.1.2 IRF3与IRF1、IRF2、IRF3及IRF7启动子的亲和分析
•     5.1.3 过表达IRF3对IRF1、IRF2、IRF3、IRF7、STING及ZDHHC1启动子活性的影响
•     5.1.4 过表达IRF3对IRF1、IRF2、IRF3及IRF7的m RNA水平影响
•   5.2 结果分析
•     5.2.1 IRF2和IRF3启动子的克隆及分析
•     5.2.2 IRF3结合IRF1、IRF2、IRF3、IRF7启动子
•     5.2.3 IRF3上调IRF1、IRF2、IRF3、IRF7的转录水平
•     5.2.4 ZDHHC1与STING启动子分析
•     5.2.5 IRF3上调ZDHHC1和STING启动子活性
•   5.3 讨论
• 第六章 主要结论、创新点及研究展望
•   6.1 主要结论
•     6.1.1 PKZ介导的信号通路
•     6.1.2 ZDHHC1和STING作为共激活因子激活IRF3
•     6.1.3 IRF3能够上调IRF1、IRF2、IRF3和IRF7的表达及反馈激活上游STING和ZDHHC1的转录
•   6.2 创新点
•   6.3 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 缩略词
• 攻读学位期间的研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 徐小文

导师: 胡成钰

关键词: 识别受体,信号通路,鱼类

来源: 南昌大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 南昌大学

分类号: Q953

DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000027

总页数: 110

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