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A型流感病毒HA融合肽+helix A线性交叉抗原表位鉴定及其重组病毒构建

2020-12-08阅读(1102)

A型流感病毒HA融合肽+helix A线性交叉抗原表位鉴定及其重组病毒构建

论文摘要

根据病毒表面囊膜糖蛋白血凝素（HA）以及神经氨酸酶（NA）抗原性,A型流感病毒目前可分为18个HA亚型以及11个NA亚型。A型流感病毒宿主范围广泛,能够引起人和多种动物的呼吸道急性感染综合症。每年由于A型流感病毒引起的人的季节性流感或时而发生的动物流感大流行或动物流感跨宿主传播的大流行直接威胁人类健康以及影响畜牧业的可持续性发展。虽然A型流感病毒疫苗以及抗病毒药物的使用在流感疾病控制中发挥了重要作用,但目前流感病毒疫苗往往具有亚型特异性或毒株特异性,流感病毒抗原性的易突变及重组特性需要不断更新疫苗毒株。因此广谱或交叉保护流感疫苗的研制是目前流感疫苗研究热点之一,那么流感病毒广谱或交叉中和表位的鉴定尤为关键。本研究首先通过pGEX-6p-1原核表达季节性流感H1N1病毒以及人源H7N9病毒的HA融合肽+helix A,并免疫BALB/C小鼠,然后运用单克隆抗体技术制备出7株抗HA融合肽+helixA特异性单克隆抗体,运用此7株单克隆抗体鉴定出了 helixA片段中交叉线性抗原表位,并将此交叉抗原表位克隆入NA引进并成功拯救了表达该表位的重组病毒。1、HA融合肽+helix A片段克隆及原核表达为获得用于制备抗HA融合肽+helix A片段单克隆抗体的免疫原,本研究将季节性流感H1N1以及人源H7N9的HA融合肽+helix A片段克隆至线性化载体pGEX-6p-1上,分别成功构建了 HA融合肽+helix A片段原核表达载体（pGEX-6P-1-GST-CA-HA2和PGEX-6P-1-GST-SH-HA2）。将获得的正确的重组质粒转化至BL21感受态中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-CA-HA2和GST-SH-HA2蛋白均以包涵体形式表达。用8M尿素将GST-CA-HA2和GST-SH-HA2蛋白进行变性后,利用GST琼脂糖凝胶柱获得纯化的 GST-CA-HA2 和 GST-SH-HA2 蛋白。GST-CA-HA2 和 GST-SH-HA2 蛋白的获得为后续免疫BALB/c小鼠研制抗HA融合肽+helix A单克隆抗体提供抗原。2、HA融合肽+helix A交叉抗原线性表位鉴定为鉴定HA融合肽+helix A交叉抗原线性表位,本研究将纯化的GST-SH-HA2和GST-CA-HA2作为免疫原,研制出了 7株能够稳定分泌出抗H7N9病毒HA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1A9,1B11,1H8,2C7,2F9,3A11和4D11。交叉反应发现,其中6株单克隆抗体能与H3N2病毒反应;5株能与H9N2有反应。多肽ELISA表位鉴定发现其中5株单克隆抗体识别helixA的C端线性表位,2个单克隆抗体识别HA融合肽线性表位。对来自不同流感病毒HA的helixA的C端表位进行了多肽合并制备抗血清。ELISA交叉反应发现单抗3A11能与不同流感病毒HA的helixA的C端表位反应,抗各自H3、H7、H9亚型的helixA的C端多抗均能与H1、H3、H7及H9亚型相应表位有交叉反应,抗H5亚型的helix A的C端多抗只与H1、H5及H9亚型相应表位有交叉反应,而抗H1亚型的helixA的C端多抗与各亚型流感病毒的相应表位无交叉反应。以上结果表明一些流感病毒亚型HA的helix A的C端表位可作为广谱或交叉抗原表位。3、表达helix A的C端表位的重组流感病毒构建为进一步研制所鉴定出的HA的helix A的C端线性表位能否提供广谱或交叉保护,本研究首先利用重组酶ExnaseTM一步克隆技术,将H7N9流感病毒HA的helix A的C端线性表位克隆到流感病毒PR8的NA基因。通过PR8流感病毒八质粒系统转染293T以及MDCK共培养细胞拯救重组流感病毒PR8-NA-helix A。通过血凝试验、RT-PCR、测序以及Westernblot证明拯救出的PR8-NA-helix A能很好与NA蛋白以融合蛋白的形式表达H7N9流感病毒HA的helix A的C端线性表位。PR8-NA-helix A重组病毒的获得为进一步探究鉴定出的HA的helix A的C端线性表位能否作为有效交叉抗原表位,刺激机体产生广谱交叉中和抗体,为将来广谱或交叉流感疫苗的研制打下了基础、提供了材料。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 文献综述
  •   1 流感病毒
  •     1.1 流感病毒的简述与分类
  •     1.2 流感病毒的基因组成及功能
  •     1.3 流感现有疫苗的种类及局限性
  •       1.3.1 多价苗
  •       1.3.2 流感病毒样粒子疫苗
  •       1.3.4 现有疫苗的局限性
  •     1.4 对HA茎区域的疫苗研究进展
  •       1.4.1 HA分子结构及功能
  •       1.4.2 针对HA茎部的疫苗相关研究
  •   2 研究目的及意义
  • 研究内容一 流感病毒HA融合肽+helix A片段克隆及原核表达
  •   1 材料
  •   2 构建重组子的方法及蛋白表达
  •     2.1 引物设计
  •     2.2 PCR扩增
  •     2.3 PCR产物胶回收
  •     2.4 重组载体的构建
  •     2.5 GST-HA2重组子的蛋白表达、纯化
  •       2.5.1 GST-HA2重组子蛋白的诱导表达
  •       2.5.2 SDS-PAGE验证蛋白表达
  •       2.5.3 Western blot验证蛋白表达
  •       2.5.4 GST-HA2蛋白纯化
  •   3 结果
  •     3.1 重组子的构建
  •     3.2 重组子的菌落PCR鉴定
  •     3.3 GST-HA2蛋白表达及纯化
  •   4 讨论
  • 研究内容二 HA融合肽+helix A交叉抗原线性表位鉴定
  •   1 材料
  •     1.1 主要试验材料
  •     1.2 主要试剂
  •     1.3 主要仪器
  •   2 单克隆抗体制备方法
  •     2.1 动物免疫
  •     2.2 抗体水平的检测
  •       2.2.1 IFA验证抗HA融合肽+helix A多抗的反应性
  •       2.2.2 Western blot验证抗GST-SH-HA2多抗的反应性
  •     2.3 细胞融合
  •       2.3.1 SP2/0细胞的制备
  •       2.3.2 饲养细胞的制备
  •       2.3.3 SP2/0与脾细胞融合
  •     2.4 单克隆抗体检测方法的建立
  •     2.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
  •     2.6 腹水制备
  •       2.6.1 腹水纯化
  •     2.7 单克隆抗体亚类鉴定
  •     2.8 单克隆抗体特异性检测
  •       2.8.1 间接免疫荧光试验
  •       2.8.2 Western blot试验
  •     2.9 单克隆抗体病毒体外中和试验
  •   3 单克隆抗体的表位鉴定
  •     3.1 多肽的设计
  •     3.2 不同亚型病毒HA蛋白helix A的多肽设计
  •     3.3 多肽免疫小鼠
  •     3.4 酶联免疫吸附试验鉴定B细胞表位
  •     3.5 酶联免疫吸附实验检测多肽多抗的交叉反应性
  •   4 结果
  •     4.1 小鼠多抗检测结果
  •     4.2 阳性杂交瘤细胞株的建立
  •     4.3 单克隆抗体的特性鉴定
  •       4.3.1 单克隆抗体Western blot分析
  •       4.3.2 单克隆抗体的广谱性鉴定
  •     4.4 4株单抗体外病毒中和结果
  •     4.5 单克隆抗体识别HA融合肽+helix A表位鉴定
  •     4.6 多种亚型病毒的HA蛋白helix A多肽免疫结果
  •   5 讨论
  • 研究内容三 表达helix A的C端表位的重组流感病毒构建
  •   1 材料
  •     1.1 SPF鸡胚及细胞
  •     1.2 生物材料
  •     1.3 试剂、耗材及试剂盒
  •     1.4 实验仪器
  •     1.5 试剂配制
  •   2 实验方法
  •     2.1 HA helix A片段分析
  •     2.2 目的片段与载体的引物设计
  •     2.3 HA的helix A PCR扩增及载体构建
  •     2.4 病毒拯救
  •     2.5 血凝实验
  •     2.6 病毒的传代
  •     2.7 重组病毒NA基因测序
  •     2.8 重组病毒的Western blot验证
  •   3 结果
  •     3.1 Group1和Group2流感病毒helix A的C端序列分析
  •     3.2 重组质粒pHX-NA-helix A的构建
  •     3.3 重组质粒的鉴定
  •     3.4 病毒拯救及扩增结果
  •     3.5 重组病毒的NA基因测序
  •     3.6 重组病毒的Western blot验证
  •   4 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 攻读学位期间学术成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 李占萍

    导师: 叶建强

    关键词: 流感病毒,融合肽,原核表达,单克隆抗体,线性表位鉴定,交叉反应性,重组病毒

    来源: 扬州大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 扬州大学

    基金: 江苏省“双创团队”项目,江苏省第五期“333”工程项目

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001625

    总页数: 69

    文件大小: 4692K

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