导读:本文包含了乳糖酶基因论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:乳糖,酵母,克鲁,基因,乳酸,曲霉,宏基。
乳糖酶基因论文文献综述
王敏,席志文,黄琳娜,惠丰立[1]（2019）在《米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达》一文中研究指出为获得高活性的乳糖酶制剂,根据米曲霉乳糖酶基因序列以及宿主细胞乳酸克鲁维酵母GG799密码子的偏爱性,对米曲霉乳糖酶基因进行优化。将已优化的米曲霉乳糖酶lacA基因片段插入到乳酸克鲁维酵母GG799表达载体pKLAC1中,构建重组载体p KLAC1-lacA,用电脉冲法将SacⅡ酶线性化的重组质粒转入乳酸克鲁维酵母GG799中。经过5 mmol/L酵母碳基础培养基(yeast carbon base,YCB)活性筛选,全细胞聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定,最后获得了一株多拷贝整合的基因工程菌株lacA-1。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)和薄层层析分析(thin-layer chromatography,TLC),该重组菌株可胞外分泌乳糖酶,并具有生物活性。摇瓶发酵培养120 h,酶活力最高达到120.65 U/mL。本研究成功地将米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母GG799中表达,获得的重组菌株lacA-1可胞外分泌的乳糖酶并有较高的乳糖酶活性,试验结果为利用乳酸克鲁维酵母GG799表达系统规模化生产乳糖酶奠定基础。(本文来源于《食品研究与开发》期刊2019年07期）
王敏[2]（2018）在《产乳糖酶基因工程菌的构建及发酵条件优化》一文中研究指出乳糖酶又称β-D半乳糖苷酶,可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶作为一种生物酶制剂,在医药上主要用来治疗乳糖不耐受症;在食品工业上主要添加在乳制品中制成低乳糖奶制品。针对目前乳糖酶工业化中生产存在的问题,如产酶量低、胞内分泌,回收率低等,结合现代基因工程技术,选取米曲霉乳糖酶为目的基因,乳酸克鲁维酵母GG799为宿主细胞,重组构建一株可胞外分泌、酶学性质好、表达水平高的新型产乳糖酶工程菌株。根据乳酸克鲁维酵母密码子的偏爱性,在不改变原氨基酸序列的前提下,以米曲霉乳糖酶基因为模板,对米曲霉乳糖酶基因序列人工合成并进行优化。优化后的乳糖酶基因lacA序列全长2982 bp,GC含量由原来的51.4%降低到39.2%,共改变了基因序列中的678个基因位点,高频密码子大幅度增加。将优化后的乳糖酶基因序列lacA连接至pKLAC1载体的XhoⅠ/BglⅡ位点之间构建载体pKLAC1-lacA,用电脉冲法将经SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中,酵母基本碳源培养基YCB富集得到大量转化子。经过多次电转,筛选出一株可高效分泌表达乳糖酶的重组酵母工程菌株lacA-1。经全细胞PCR鉴定该工程菌株lacA-1为多拷贝整合菌株,SDS-PAGE电泳检测该工程菌株可胞外分泌乳糖酶,薄层层析鉴定该工程菌株分泌的乳糖酶能将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,具有生物活性。对乳酸克鲁维酵母工程菌株lacA-1发酵培养基中碳源、氮源、生长因子、无机盐分别进行单因素优化,在此基础上结合正交试验,确定了最优培养基成分为:乳糖4%,酵母粉6%,玉米浆5%,硫酸镁0.1%,硫酸锰0.03%。最佳发酵条件为:接种量为10%,pH为初始pH,发酵温度28℃,转速200 r/min,装液量为50 mL/250 mL,培养时间120 h。在此条件下进行摇瓶发酵,乳糖酶活力为142.57 U/mL,是初始发酵培养基的5.81倍。对工程菌株lacA-1所产乳糖酶酶学性质进行初步研究,实验结果表明:该重组乳糖酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0,在4℃低温保存30 d残酶活力仍有原始的82.73%,反应温度为70℃时残酶活力仍为原始酶活力的95%,热稳定性远优于米曲霉所产乳糖酶。综上所述,本研究采用基因工程方法成功的构建出一株可胞外分泌、乳糖酶活性高、酶学性质好、后续纯化简单、生产过程安全的新型工程菌株,为乳糖酶在食品、医药等工业上的应用奠定了基础。(本文来源于《南阳师范学院》期刊2018-12-01）
李晓琴[3]（2018）在《牛奶摄入和乳糖酶基因多态性对不同乳糖消化状况人群的肠道菌群和代谢状态的影响》一文中研究指出牛奶营养成分齐全,组成比例适宜,是膳食钙的最佳来源。增加牛奶及奶制品的摄入不仅可以降低骨质疏松、高血压、心血管疾病等多种慢性非传染性疾病的风险,还可以降低全因死亡率。然而,我国居民牛奶及奶制品的实际摄入量仅24.7 g/d,远低于中国居民膳食指南的推荐摄入量(300 g/d)。乳糖消化不良人群小肠内缺乏乳糖酶,牛奶中的乳糖无法在小肠代谢,而是由结肠细菌发酵生氢气、二氧化碳和甲烷等气体以及短链脂肪酸。一部分人会因此出现腹鸣、腹胀、腹痛以及腹泻等不适症状,即乳糖不耐受。我国居民的乳糖消化不良流行率高达86%,这很大程度上限制了人们对牛奶及奶制品的摄入,对我国居民的营养与健康状况产生长期影响。因此,深入地探讨牛奶摄入对不同乳糖消化状况人群代谢健康和肠道菌群的影响,对制定个性化的牛奶摄入推荐,指导居民合理饮用牛奶,促进和改善居民营养健康状况具有重要意义。第一部分牛奶摄入对不同乳糖消化状况人群代谢状态的影响目的:探讨牛奶摄入对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群人体测量学指标、血压以及生化指标的影响。方法:本研究是针对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群的膳食干预研究。首先,采用氢呼气实验筛查乳糖消化不良和乳糖消化良好人群。然后,根据氢呼气实验的结果,按性别、年龄、身体质量指数(Body mass index,BMI)及基线乳制品摄入量1:1匹配纳入乳糖消化良好和乳糖消化不良受试者。牛奶干预期间,所有受试者每天摄入250 mL全脂牛奶,随餐饮用,保持原有的膳食习惯不变,干预时间为4周。干预开始和结束前,所有受试者按要求完成叁天的膳食调查,集中进行人体测量学检查并采集空腹血液样本。采用标准的方法进行人体测量学的检查,使用相应试剂盒测定血浆中糖脂代谢指标、炎症因子和氧化应激指标的含量,同时采用全自动生化分析仪测定血浆中肝肾功能指标的含量。结果:本研究共完成227人的氢呼气实验,乳糖消化良好32人(占14.1%),乳糖消化不良195人(占85.9%)。按性别、年龄、BMI及基线乳制品摄入量1:1匹配,共有31名乳糖消化不良和31名乳糖消化良好受试者纳入牛奶干预试验。其中,男性44人,女性18人,年龄为20~31岁,BMI为16.3~25.9 kg/m~2。所有受试者均按要求完成了试验,失访率为0。干预前,乳糖消化不良和乳糖消化良好组的身高、体重、BMI、腰围、臀围、血压、糖脂代谢指标、炎症因子和氧化应激指标均不存在显着统计学差异。在牛奶干预过程中,受试者的依从性良好,干预后所有受试者的乳制品生物标志物(血浆十五烷酸)显着升高(P<0.001)。牛奶干预期间,能量和叁大产能营养素的摄入量及供能比均未发生显着改变。牛奶摄入对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群的体重、BMI以及血压均没有显着的影响,但是显着地降低了乳糖消化不良和乳糖消化良好人群的体脂含量(P=0.034,P=0.015)和体脂率(P=0.018,P=0.022),然而两组的改变不具有显着统计学差异。牛奶摄入对两组受试者糖脂代谢、炎症因子、氧化应激和肝肾功能指标的影响均不具有显着统计学意义,且两组的改变不具有显着统计学差异。结论:每天摄入250 mL牛奶对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群代谢健康的影响没有显着的统计学差异,适量牛奶摄入对乳糖消化不良人群的代谢健康没有不利影响。第二部分牛奶摄入对不同乳糖消化状况人群肠道菌群及其代谢产物的影响目的:探讨牛奶摄入对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群肠道菌群及其代谢产物的影响,同时考查所有受试者的肠型分类,评估肠型差异对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群牛奶健康效应的影响。方法:干预开始和结束前叁天,所有受试者按要求采集一次粪便样本。采用16S rRNA基因扩增子测序分析肠道菌群组成,采用高效气相色谱-质谱联用技术测定粪便和血浆中短链脂肪酸的含量。依据属水平肠道菌群的组成,对所有受试者进行肠型分析。结果:牛奶摄入对乳糖消化不良和乳糖消化良好人群肠道菌群的结构没有显着影响,但是选择性地改变了乳糖消化不良人群肠道菌群的组成。牛奶干预后,乳糖消化不良组放线菌门(Actinobacteria)(P<0.001,FDR=0.001)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)(P<0.001,FDR<0.001)和产短链脂肪酸的细菌Anaerostipes(P<0.001,FDR<0.001)、Blautia(P=0.037,FDR=0.111)的相对丰度显着增加,并且两组间上述菌群的改变均具有显着的统计学差异(Actinobacteria:P=0.018;Bifidobacterium:P=0.029;Anaerostipes:P=0.016;Blautia:P=0.003)。牛奶摄入对两组受试者粪便和血浆短链脂肪酸的含量均没有显着影响。从肠型来看,牛奶摄入使拟杆菌肠型乳糖消化不良人群放线菌门(P=0.016)和双歧杆菌属(P=0.004)的相对丰度显着增加,但对拟杆菌肠型乳糖消化良好人群以及普氏菌肠型人群的肠道菌群组成均没有显着影响。牛奶摄入使拟杆菌肠型人群的体脂含量(P<0.001,P=0.020)和体脂率(P<0.001,P=0.025)显着降低,但对普氏菌肠型人群没有产生显着影响。结论:每天摄入250 mL牛奶对乳糖消化不良人群具有显着的双歧生成效应,可以选择性地改变乳糖消化不良人群肠道内有益菌的相对丰度,而且牛奶摄入对拟杆菌肠型乳糖消化不良人群的双歧生成效应更显着。第叁部分牛奶摄入和乳糖酶基因多态性的交互作用对机体肠道菌群及代谢状态的影响目的:筛选中国人群中与乳糖消化不良相关的乳糖酶基因多态性位点,评估多个乳糖酶基因多态性位点对乳糖消化不良的预测效果,深入探讨牛奶摄入和乳糖酶基因多态性的交互作用对机体肠道菌群及代谢状态的影响。方法:采用Tag SNP法筛选与乳糖消化不良相关的乳糖酶基因多态性位点,采用基因芯片进行基因分型,计算加权和未加权的遗传风险评分(Genetic risk score,GRS)以评估多个位点对乳糖消化不良的预测效果。结果:已发现在欧洲人群中与乳糖消化不良显着相关的两个位点(rs4988235和rs182549)与中国汉族人群的乳糖消化不良不存在显着关联。在乳糖酶基因LCT及其上游与LCT转录调控相关的基因MCM6中选定的24个Tag SNP中,rs11903319(P=0.010)和rs72972158(P=0.020)与乳糖消化不良显着相关。由多个乳糖酶基因多态性位点计算得到的加权GRS评分对乳糖消化不良具有较好的预测性,高GRS组乳糖消化不良风险显着高于低GRS组(OR=27,95%CI:3~285,P=0.006)。牛奶摄入使不同乳糖消化不良遗传风险人群的体脂含量(低GRS:P=0.015;中GRS:P=0.027;高GRS:P=0.038)和体脂率(低GRS:P=0.020;中GRS:P=0.035;高GRS:P=0.044)显着降低,但是牛奶摄入和乳糖酶基因多态性的交互作用对人体测量学、糖脂代谢、炎症和氧化应激等各指标的影响均不具有显着的统计学意义。虽然牛奶摄入和乳糖酶基因多态性的交互作用对肠道菌群结构的影响不具有显着的统计学意义,但是对放线菌门(P=0.010)和双歧杆菌属(P=0.036)相对丰度的影响具有显着统计学意义。牛奶干预后,高乳糖消化不良遗传风险人群的放线菌门(P=0.021,FDR=0.092)和双歧杆菌属(P=0.033,FDR=0.092)的相对丰度显着增加。结论:牛奶摄入对高乳糖消化不良遗传风险人群具有显着的双歧生成效应,但是对其代谢健康无不利影响。因此,牛奶可以作为乳糖消化不良人群膳食的一部分,这对制定个性化的牛奶摄入推荐,改善我国居民的营养健康状况,尤其对提高膳食钙摄入水平具有十分重要的意义。(本文来源于《华中科技大学》期刊2018-05-01）
龙承星,贺璐,刘又嘉,惠华英,谭周进[4]（2017）在《肠道细菌乳糖酶基因多样性分析通用引物》一文中研究指出为深入研究肠道细菌乳糖酶基因多样性,根据NCBI公布的细菌乳糖酶基因[Beta-galactosidase(lac Z)]序列,利用软件Primer Premier 5.0前后设计合成7对通用引物,经过PCR扩增、宏基因组测序和生物信息学分析进行引物筛选.PCR扩增电泳中,436R、375R、217R和406R四对引物没有扩增出目的片段,436、324和194叁对引物均有目的条带扩出.内容物样品扩增,436引物条带最清晰,灵敏性高,324和194引物条带质量相差不大;粘膜样品扩增,324引物均扩增出目的条带,条带清晰明亮.436引物只扩增出一个样品的目的条带,灵敏度较差;194引物扩增杂带多,特异性差.样品序列统计方面,删除宿主序列信息后,内容物样品中,194、324和436叁对引物最终序列比例均达98%以上;粘膜样品中,194引物特异性最差,436引物最好,324引物居中.OTU聚类和注释方面,内容物样品中,324引物扩增物种也较436引物多;粘膜样品中,324引物能聚类最多的物种.Alpha多样性方面,内容物样品中,324引物的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数较436引物大,436引物的Simpson、Shannon指数较194引物大;粘膜样品中,324引物的Chao1、ACE、Simpson、Shannon指数均较436引物大.综合分析,对肠道内容物和肠道粘膜细菌乳糖酶基因多样性研究选用324通用引物最佳.(本文来源于《应用与环境生物学报》期刊2017年04期）
龙承星,贺璐,刘又嘉,郭艳芳,于子真[5]（2017）在《菌群失调腹泻造模及七味白术散治疗对小鼠乳糖酶基因13910多态性的影响》一文中研究指出目的探讨抗生素及七味白术散对菌群失调腹泻小鼠乳糖酶基因13910位点多态性的影响。方法将36只SPF级小鼠随机分为正常组(12只)、模型组(12只)、七味白术散组(6只)和乳糖酶组(6只),除正常组外的其余小鼠采用混合抗生素造成菌群失调腹泻模型,然后分别灌胃七味白术散和乳糖酶治疗。造模成功和治疗后分别提取小鼠肠道内容物和肠道黏膜宏基因组,对包括小鼠乳糖酶基因13910位点在内的1 036bp长度的DNA片段进行单核苷酸多态性(SNP)测序分析。结果造模和治疗后,小鼠乳糖酶基因13910位点没有发生碱基的变异,均为A/A型,13910位点在内的1 036bp范围内也没有新的SNP位点出现。结论菌群失调腹泻造模与七味白术散治疗对小鼠乳糖酶活性的干预均与小鼠乳糖酶基因13910位点多态性没有相关性,可能存在其他多态性位点或其他方面的调控机制。(本文来源于《中国微生态学杂志》期刊2017年07期）
邢竹青,王彦宁,刘兆贤,邬亚男,梁丽[6]（2016）在《Lactobacillus kefiranofaciens乳糖酶基因克隆及在毕赤酵母中表达》一文中研究指出以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到乳糖酶中Lac L、Lac M两个大小亚基片段,经Eco RI和Sna BI双酶切后,分别连接p PIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确。将重组质粒p PIC9K-Lac L、p PIC9K-Lac M分别电转化毕赤酵母GS115,构建p PIC9K-Lac L-GS115重组子和p PIC9K-Lac M-GS115重组子,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m L,具有多拷贝基因的重组子。经反转录PCR验证,c DNA上存在Lac L片段,并可检测到乳糖酶酶活达到1.17 U/m L;p PIC9K-Lac M-GS115重组子诱导表达72 h后的发酵液上清经SDS蛋白电泳检测到目的条带。(本文来源于《中国酿造》期刊2016年01期）
何熹,耿伟涛,韩宁,王艳萍[7]（2016）在《马奶酒样乳杆菌乳糖酶LacZ基因的克隆,原核表达及活性分析》一文中研究指出从开菲尔粒(Kefir)中分离出1株马奶酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3),具有较高的乳糖酶活性,以此菌株为材料,从其基因组中克隆得到LacZ型乳糖酶基因,该基因全长2007 bp,编码669个氨基酸。随后将该基因插入原核表达载体pET-32a中转入大肠杆菌BL21(DE3)进行过量表达,获得了其重组蛋白,纯化后分析了该重组蛋白的乳糖水解活性特点。结果显示,此蛋白在50℃,pH 7.0时乳糖水解活力最高,并在30~55℃,pH 5.0~9.0的范围仍能保持50%以上的酶活力,具有良好的工业应用潜力。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2016年04期）
王彦宁[8]（2015）在《马乳酒样乳杆菌ZW3中乳糖酶基因LacLM在毕赤酵母中的克隆表达》一文中研究指出乳糖酶(lactase),学名 β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase,EC3.2.1.23),催化乳糖水解作用,将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,或发生转糖苷反应生成低聚半乳糖。目前乳糖酶在制备低乳糖牛乳制品等方面广泛应用,可以有效地降低乳糖不耐受症。其中来源于乳酸菌的乳糖酶为中性乳糖酶,安全性较高,最适催化温度介于40℃～60℃之间,可满足生产乳制品的要求,但其不能分泌到胞外,分离纯化的难度很大,给大规模生产带来困难。因此本文对来自于乳酸菌的乳糖酶基因导入毕赤酵母中进行克隆于表达。本文对来自乳酸菌产马乳酒乳杆菌ZW3(Lactobacillus kefiranofaciens ZW3)的乳糖酶基因LacLM进行生物信息学分析,该基因全长2833bp,可编码由948个氨基酸组成的蛋白,其编码的β-D-半乳糖苷酶为一疏水性蛋白,其中大亚基LacL全长1887bp,可编码628个氨基酸,其中小亚基LacM全长963bp,可编码320个氨基酸,大小亚基有17bp的重迭序列,大小亚基都不含信号肽,均属于非分泌型胞内蛋白。本文又探索了以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组编码的乳糖酶基因在毕赤酵母中进行克隆表达。以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到LacL、LacM两个乳糖酶大小亚基片段,分别经EcoR I和SnaB I双酶切后,分别连接pPIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确无误。将重组质粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分别电转入毕赤酵母 GS115,构建 pPIC9K-LacL-GS115重组子和pPIC9K-LacM-GS115重组子,通过筛选抗G418浓度达到3.0mg/mL的菌株,得到了具有多拷贝基因的重组子。pPIC9K-LacL-GS115重组子经反转录PCR验证,cDNA上存在LacL片段,并可检测到乳糖酶酶活性为1.17U/mL。pPIC9K-LacM-GS115重组子诱导表达120h后,其发酵液上清经SDS-PAGE蛋白电泳检测到目的条带,但没有表现乳糖酶活性。通过对毕赤酵母pPIC9K-LacL-GS115重组子摇瓶条件下的培养条件优化,乳糖酶酶活最高达到了1.44 U/mL,比优化前提高了23%。(本文来源于《天津科技大学》期刊2015-12-01）
张霞[9]（2015）在《基因工程技术生产乳糖酶的研究》一文中研究指出乳糖酶,学名为β-半乳糖苷酶,能够特异性的水解p-D-半乳糖苷键,催化乳糖水解,生成葡萄糖和半乳糖。乳糖酶的应用范围非常广泛,它能够水解牛奶及乳制品中的乳糖,减少乳糖不耐症的发生；可以用于改良乳制品；用于分析检测等。目前工业上生产的乳糖酶成本高,本研究利用基因工程技术,尝试在大肠杆菌和毕赤酵母中表达外源的乳糖酶,对乳糖酶的酶学性质进行研究,发酵条件进行优化,得到如下结论：1)分别成功构建了pETDuet-1-lac4, pMAL-c2x-lac4, pET22b(+)-lac4, pET28a(+)-lac4四种不同质粒,并对其进行诱导表达,其中pET22b(+)-lac4重组质粒的乳糖酶的酶活达到最高2.121 U.mL-1发酵液。2)测定了pET22b(+)-lac4的重组酶的酶学性质,乳糖酶的最适pH 7.0,最适宜温度为45℃,在45℃保存4h酶活依然在80%以上,K+对于乳糖酶酶活基本没有影响,Mn~(2+),Ca~(2+)浓度为分别为1 5 mM,25 mM时乳糖酶的酶活达到最大,Zn~(2+)对于乳糖酶的酶活具有抑制作用。3)对于大肠杆菌的发酵条件,诱导的条件进行了优化,在甘油浓度为4%,酵母粉3%,蛋白胨3%的条件进行发酵,IPTG诱导浓度为0.5 mM,在28℃条件下诱导21 h,检测到的乳糖酶的酶活达到37.38 U.mL-1发酵液。4)成功构建了毕赤酵母的分泌型重组质粒,但没有检测到乳糖酶的酶活。(本文来源于《北京化工大学》期刊2015-05-29）
杨卉新,杜海廷,田玉民[10]（2014）在《乳糖酶及其基因的研究进展》一文中研究指出综述了动物和人的乳糖酶结构和功能以及乳糖酶基因的结构和表达特点,并探讨了乳糖酶基因多态性与乳糖不耐症的关系。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2014年17期）
乳糖酶基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
乳糖酶又称β-D半乳糖苷酶,可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷转移作用。乳糖酶作为一种生物酶制剂,在医药上主要用来治疗乳糖不耐受症;在食品工业上主要添加在乳制品中制成低乳糖奶制品。针对目前乳糖酶工业化中生产存在的问题,如产酶量低、胞内分泌,回收率低等,结合现代基因工程技术,选取米曲霉乳糖酶为目的基因,乳酸克鲁维酵母GG799为宿主细胞,重组构建一株可胞外分泌、酶学性质好、表达水平高的新型产乳糖酶工程菌株。根据乳酸克鲁维酵母密码子的偏爱性,在不改变原氨基酸序列的前提下,以米曲霉乳糖酶基因为模板,对米曲霉乳糖酶基因序列人工合成并进行优化。优化后的乳糖酶基因lacA序列全长2982 bp,GC含量由原来的51.4%降低到39.2%,共改变了基因序列中的678个基因位点,高频密码子大幅度增加。将优化后的乳糖酶基因序列lacA连接至pKLAC1载体的XhoⅠ/BglⅡ位点之间构建载体pKLAC1-lacA,用电脉冲法将经SacⅡ线性化的重组质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799中,酵母基本碳源培养基YCB富集得到大量转化子。经过多次电转,筛选出一株可高效分泌表达乳糖酶的重组酵母工程菌株lacA-1。经全细胞PCR鉴定该工程菌株lacA-1为多拷贝整合菌株,SDS-PAGE电泳检测该工程菌株可胞外分泌乳糖酶,薄层层析鉴定该工程菌株分泌的乳糖酶能将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,具有生物活性。对乳酸克鲁维酵母工程菌株lacA-1发酵培养基中碳源、氮源、生长因子、无机盐分别进行单因素优化,在此基础上结合正交试验,确定了最优培养基成分为:乳糖4%,酵母粉6%,玉米浆5%,硫酸镁0.1%,硫酸锰0.03%。最佳发酵条件为:接种量为10%,pH为初始pH,发酵温度28℃,转速200 r/min,装液量为50 mL/250 mL,培养时间120 h。在此条件下进行摇瓶发酵,乳糖酶活力为142.57 U/mL,是初始发酵培养基的5.81倍。对工程菌株lacA-1所产乳糖酶酶学性质进行初步研究,实验结果表明:该重组乳糖酶最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0,在4℃低温保存30 d残酶活力仍有原始的82.73%,反应温度为70℃时残酶活力仍为原始酶活力的95%,热稳定性远优于米曲霉所产乳糖酶。综上所述,本研究采用基因工程方法成功的构建出一株可胞外分泌、乳糖酶活性高、酶学性质好、后续纯化简单、生产过程安全的新型工程菌株,为乳糖酶在食品、医药等工业上的应用奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
乳糖酶基因论文参考文献
[1].王敏,席志文,黄琳娜,惠丰立.米曲霉乳糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达[J].食品研究与开发.2019
[2].王敏.产乳糖酶基因工程菌的构建及发酵条件优化[D].南阳师范学院.2018
[3].李晓琴.牛奶摄入和乳糖酶基因多态性对不同乳糖消化状况人群的肠道菌群和代谢状态的影响[D].华中科技大学.2018
[4].龙承星,贺璐,刘又嘉,惠华英,谭周进.肠道细菌乳糖酶基因多样性分析通用引物[J].应用与环境生物学报.2017
[5].龙承星,贺璐,刘又嘉,郭艳芳,于子真.菌群失调腹泻造模及七味白术散治疗对小鼠乳糖酶基因13910多态性的影响[J].中国微生态学杂志.2017
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