灵芝多糖合成途径关键酶在大肠杆菌中的异源表达与酶学性质研究

论文摘要

灵芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide,GLP）是灵芝发酵过程中的主要活性产物,具有抗肿瘤、降血糖血脂等多种生物活性。目前,有关灵芝多糖的合成途径并未完全明晰,其中涉及到的关键酶数量众多且特性不明。本课题在前期构建的灵芝多糖核苷单糖供体合成途径基础上,对其中的关键酶——葡萄糖磷酸变位酶（PGM）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPG）和磷酸甘露糖异构酶（PMI）的性质与催化特点展开研究,完善灵芝中相关研究内容,也为大幅促进灵芝多糖合成发酵策略的制定提供有效的依据,主要研究内容与结果如下:（1）将灵芝来源的关键酶基因gl-pgm,gl-ugpg和gl-pmi分别构建到大肠杆菌表达载体pET-28a（+）上,转化至相应基因缺陷的宿主细胞E.coli BL21（DE3）,获得三株重组菌株E.coli-QCpgm/pET28a（+）-gl-pgm、E.coli-QCugpg/pET28a（+）-gl-ugpg和E.coli-QCpmi/pET28a（+）-gl-pmi。对重组菌株进行诱导重组酶的表达,并借助Co-NTA树脂进行重组酶的分离纯化,获得纯化的重组酶GLpgm、GLugpg和GLpmi,比酶活分别为4.75 U·mg-1、6.26 U·mg-1和13.68 U·mg-1。（2）对重组酶进行酶学性质研究,其结果显示,纯化后的GLpgm的最适反应pH为8.5,GLugpg和GLpmi的最适pH为7.5;GLpgm、GLugpg和GLpmi最适反应温度依次为35、40和30°C,均与植物及真菌来源的酶较为相似;重金属Ag+、Cu2+及化学试剂SDS对关键酶均具有较强的抑制作用;同其他来源的酶类似,灵芝来源的三个关键酶的活力均受到金属离子Mn2+、Mg2+的促进作用;GLpgm、GLugpg、GLpmi的Km和kcat/Km值分别为0.68 mmol·L-1和196.08 mmol·L-1·s-1、0.25 mmol·L-1和818.60mmol·L-1·s-1、0.50 mmol·L-1和1105.22 mmol·L-1·s-1,与其他来源的酶相比,本研究中灵芝来源关键酶对底物的催化效率相对较高。（3）初步研究了灵芝液体发酵过程中金属离子Mg2+和Mn2+的调控作用。结果表明在发酵水平上,5 mmol·L-11 Mg2+和Mn2+的添加对灵芝发酵过程中的生物量、胞外多糖产量（EPS）、胞内多糖含量（IPS）及关键酶酶活都有明显的促进作用,其中生物量分别提高了23.26%、42.04%,YEPS/生物量得率提高了34.04%、25.53%,IPS含量提高了31.20%、15.67%。在转录水平上,Mg2+和Mn2+的添加提高了灵芝菌体胞内的关键酶PGM、UGPG和PMI的基因转录,其中Mg2+更显著的促进PGM、UGPG的基因转录,分别是对照组的4.20倍、2.68倍;Mn2+更明显的促进PMI的基因转录,是对照组的5.66倍。Mg2+和Mn2+通过提高多糖合成途径中关键酶的基因转录水平,促进灵芝多糖的大量合成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 灵芝多糖的概述
•     1.1.1 影响灵芝多糖的生物活性因素
•     1.1.2 灵芝多糖的生物活性
•   1.2 灵芝多糖生物合成途径的研究进展
•     1.2.1 灵芝多糖生物合成途径
•     1.2.2 灵芝多糖的核苷糖供体合成关键酶
•   1.3 提高灵芝多糖产量的研究
•     1.3.1 培养基成分的优化
•     1.3.2 构建工程菌株
•   1.4 立题意义与研究内容
•     1.4.1 立题意义
•     1.4.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌种、质粒与引物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•     2.1.4 培养基与试剂
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 构建靶标基因缺陷菌株
•     2.2.2 基因克隆与序列分析
•     2.2.3 重组菌株的构建
•     2.2.4 重组酶的诱导表达、分离纯化
•     2.2.5 重组酶纯酶性质研究
•     2.2.6 外源添加Mg2+、Mn2+对灵芝发酵的影响
•   2.3 测定方法
•     2.3.1 关键酶活力测定
•     2.3.2 总蛋白含量测定
•     2.3.3 菌体干重（DCW）测定
•     2.3.4 胞外多糖（EPS）产量测定
•     2.3.5 胞内粗多糖（IPS）产量测定
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 重组菌株的构建、表达与蛋白纯化
•     3.1.1 靶标基因缺失菌株的构建
•     3.1.2 缺陷菌株生长情况
•     3.1.3 基因的克隆与分析
•     3.1.4 重组菌株的构建
•     3.1.5 重组酶的表达与纯化
•   3.2 重组酶酶学性质研究
•     3.2.1 最适反应pH和 pH稳定性
•     3.2.2 最适反应温度和热稳定性
•     3.2.3 金属离子对重组酶的影响
•     3.2.4 有机试剂对重组酶的影响
•     3.2.5 酶促反应动力学参数测定
•     3.2.6 关键酶的序列特征预测与三维结构模拟
•     3.2.7 不同来源PGM、UGPG及 PMI酶学性质比较
•   3.3 外源添加低浓度Mg2+和Mn2+对灵芝液态发酵的影响
•     3.3.1 不同Mg2+、Mn2+浓度对多糖产量的影响
•     3.3.2 生物量与多糖的变化
•     3.3.3 关键酶活性变化
•     3.3.4 关键酶的基因表达变化
• 主要结论与展望
•   主要结论
•   展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录B：文中涉及的基因信息

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李阳

导师: 丁重阳

关键词: 磷酸葡萄糖变位酶,葡萄糖焦磷酸化酶,磷酸甘露糖异构酶,异源表达,酶学性质

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ925

总页数: 58

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