基于核酶的自剪切sgRNA及其在基因编辑中的应用

论文摘要

为减少在CRISPR/Cas9基因编缉系统中,sgRNA通常由Ⅲ型启动子持续转录产生,Ⅲ型启动子不易控制,sgRNA持续表达又容易产生细胞毒性这一缺陷,本文拟建立由Ⅱ型启动子转录,并由内含子中释放sgRNA的方法.我们在sgRNA的两端设计了三种"核酶-sgRNA-核酶"的组合,通过核酶的自剪切作用实现sgRNA的释放.实验结果表明,HHRz-sgRNA-HDVRz的设计能够正确的从内含子中释放sgRNA,并且该sgRNA在构建的copGFP敲除模型中能够实现有效的基因编辑.这一发现证明在哺乳动物细胞中利用Ⅱ型启动子,在核酶和内含子剪切的协助下可以实现sgRNA的表达,这为Cas9和sgRNA整合在一个Ⅱ型启动子之下实现组织特异性和药物诱导性表达提供了基础.

论文目录

• 1 引 言
• 2 材料和方法
•   2.1 材料和试剂
•   2.2 方 法
•     2.2.1 慢病毒的包装及感染
•     2.2.2 western blot
•     2.2.3 RT-PCR
•     2.2.4 T7 EN1 cleavage assay
• 3 结果与分析
•   3.1 实验方案设计
•   3.2 copGFP稳定表达的293FT细胞株的构建
•   3.3 筛选靶向copGFP的高效sgRNA
•   3.4 Flipo中插入含三种核酶组合的球蛋白内含子, 不影响Flipo的表达
•   3.5 核酶-sgRNA-核酶组合中HHRz-sgRNA-HDVRz组合能够实现sgRNA的正确释放
•   3.6 HHRz-sgRNA-HDVRz组合释放的sgRNA能够有效敲除copGFP
• 4 讨 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 单策,李中瀚

关键词: 系统,内含子,核酶

来源: 四川大学学报(自然科学版) 2019年02期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 四川大学生命科学学院

基金: 国家自然科学基金青年基金(31401262)

分类号: Q78

页码: 345-350

总页数: 6

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