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α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响

2020-12-02阅读(794)

α-factor信号肽及其N-糖基化修饰对毕赤酵母外源蛋白分泌的影响

论文摘要

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统因其兼具真核生物和原核生物的特点,自投入使用以来,已成功使用该系统表达了超过1000种的外源蛋白。作为外源蛋白表达系统,表达量是其最核心的评价指标之一。在毕赤酵母中,虽然有一些蛋白能得到高分泌表达,但多数蛋白在毕赤酵母中分泌表达量只能达到mg/L级。因此,如何找到一种普适性的方法,提高毕赤酵母中信号肽引导的外源蛋白分泌表达量,这对于完备毕赤酵母表达系统具有重要的意义。信号肽是分泌蛋白进入分泌通道重要先决条件,对蛋白的分泌表达有重要影响。本研究从信号肽入手,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告蛋白,研究S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种酵母α-factor信号肽及其前导肽对报告蛋白分泌表达的影响。研究发现,S.cerevisiaeα-factor信号肽可以很好的引导EGFP的分泌表达,而K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下;S.cerevisiaeα-factor信号肽引导的外源蛋白胞外表达量是K.pastoris和K.phaffii的98.2倍和13.5倍。从外源蛋白胞内滞留、蛋白降解、基因整合拷贝数、转录水平、密码子偏好性等方面对S.cerevisiae、K.pastoris和K.phaffii三种α-factor信号肽进行分析,发现K.pastoris和K.phaffii的α-factor信号肽对EGFP分泌表达效率低下并非是这些原因造成。对三种α-factor信号肽潜在N-糖基化位点进行分析,发现S.cerevisiaeα-factor信号肽的前导肽上存在三个N-糖基化位点,而在K.pastoris和K.phaffii的α-factor上没有N-糖基化位点。将S.cerevisiaeα-factor前导肽三个N-糖基化位点上的N突变成Q,使之不能被N-糖基化,其表达量下降了近50.3%。同时,在K.pastoris和K.phaffiiα-factor前导肽上引入一个N-糖基化位点后,表达量有显著提高,分别提高了31.5倍和5.2倍。这些结果说明α-factor前导肽的N-糖基化修饰有助于外源蛋白的分泌表达,K.pastoris和K.phaffiiα-factor信号肽不能很好引导外源蛋白的分泌是由于缺少N-糖基化而引起的。进一步以S.cerevisiaeα-factor信号肽为模型,研究前导肽上N-糖基化的数量和位置对分泌表达的影响,结果表明,前导肽上N-糖基化的数量和位置对表达量没有明显影响。本研究为提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达量提供了技术手段,也为进一步的机制研究奠定很好的前期基础,同时,也为外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达所需的信号肽提供了更多的选择。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 绪论
  •   1 巴斯德毕赤酵母表达系统的发展与优势
  •   2 毕赤酵母菌株的发展与分类
  •   3 毕赤酵母醇氧化基因和醇氧化酶启动子p AOX1-2 -
  •     3.1 毕赤酵母醇氧化基因
  •     3.2 醇氧化酶启动子pAOX1
  •   4 常用的巴斯德毕赤酵母表达载体
  •   5 外源基因的整合方式
  •   6 毕赤酵母前体蛋白转化酶Kex2
  •   7 糖基化
  •     7.1 酵母细胞内的糖基化类型
  •     7.2 糖基化对蛋白的影响
  •     7.3 毕赤酵母的糖基化的特点
  •     7.4 毕赤酵母糖基化的缺点与现况
  •   8 信号肽的发展与结构
  •     8.1 信号肽假说
  •     8.2 毕赤酵母信号肽分泌方式
  •     8.3 毕赤酵母常用信号肽的类型
  •     8.4 毕赤酵母常用信号肽的可能影响因素
  •     8.5 毕赤酵母常用信号肽存在的一些问题
  •   9 毕赤酵母表达系统的缺点
  •   10 本研究的目的和意义
  • 第一章 实验材料与方法
  •   第一节 实验材料
  •     1.1.1 菌株与质粒
  •     1.1.2 常用的培养基
  •     1.1.3 主要试剂
  •     1.1.4 主要仪器及试剂盒
  •     1.1.5 寡聚核苷酸引物
  •     1.1.6 重组质粒列表
  •     1.1.7 重组菌株列表
  •   第二节 实验方法
  •     1.2.1 质粒的转化
  •     1.2.2 质粒DNA的提取
  •     1.2.3 PCR反应
  •     1.2.4 RT PCR和Realtime PCR
  •     1.2.5 点突变PCR
  •     1.2.6 酶切反应
  •     1.2.7 连接反应
  •     1.2.8 载体重组反应
  •     1.2.9 酵母感受态细胞的制备
  •     1.2.10 毕赤酵母的电转化
  •     1.2.11 酵母细胞诱导培养与胞外蛋白收获
  •     1.2.12 酵母胞内蛋白提取
  •     1.2.13 酵母基因组提取
  •     1.2.14 酵母RNA提取
  •     1.2.15 WESTERN-BOLT
  • 第二章 实验结果
  •   2.1 报告体系在毕赤酵母中的构建
  •   2.2 K.pastoris和 K.phaffii的 α-factor信号肽在毕赤酵母中表达量低
  • K.pa-EGFP和 GS115K.ph-EGFP菌株的低表达不是由于外源蛋白大量胞内滞留引起'>  2.3 GS115K.pa-EGFP和 GS115K.ph-EGFP菌株的低表达不是由于外源蛋白大量胞内滞留引起
  • K.pa-EGFP和 GS115K.pa-EGFP菌株的低表达不是因为蛋白酶体降解增加引起'>  2.4 GS115K.pa-EGFP和 GS115K.pa-EGFP菌株的低表达不是因为蛋白酶体降解增加引起
  • K.pa-EGFP和 GS115K.pa-EGFP菌株的低表达不是由于基因拷贝数、转录水平低以及密码子偏好而引起'>  2.5 GS115K.pa-EGFP和 GS115K.pa-EGFP菌株的低表达不是由于基因拷贝数、转录水平低以及密码子偏好而引起
  •   2.6 S.cerevisiaeα-factor信号肽N-糖基化有助于提高报告蛋白EGFP的分泌表达
  •   2.7 S.cerevisiaeα-factor信号肽N-糖基化的位置和数量不影响EGFP的分泌表达
  •   2.8 向K.pastoris和 K.phaffiiα-factor信号肽引入N-糖基化位点能有效提高EGFP分泌表达
  •   2.9 引入N-糖基化的K.pastoris和 K.phaffiiα-factor信号肽表达量提高不是由于蛋白胞内滞留、基因组整合拷贝数和转录水平的变化而引起
  • 第三章 分析与讨论
  •   3.1 EGFP适合在毕赤酵母中作为研究分泌效率的报告蛋白
  •   3.2 信号肽对外源蛋白分泌表达的影响
  •   3.3 糖基化对外源蛋白分泌表达的影响
  •   3.4 造成K.pastoris和 K.phaffii信号肽低表达可能的原因
  • 第四章 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
  • 致谢
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 吴静雯

    导师: 黄义德

    关键词: 毕赤酵母,信号肽,外源蛋白表达,糖基化

    来源: 福建师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 福建师范大学

    分类号: Q933

    DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000557

    总页数: 78

    文件大小: 2664k

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