拟南芥WRKY6和PR1在转录水平响应生物及非生物胁迫应答模式的研究

论文摘要

植物在整个生命周期中不可避免地承受着各种各样的环境压力。由于环境干扰可能会反复发生,植物进化形成了自身“记忆”机制,以此来适应新环境。作为诱导植物系统性抗性的一种机制,防御启动（defense priming）主要发生在转录水平上,在启动（priming）状态下,植物能够更快、更强、更敏感地响应生物和非生物胁迫。同时,植物还进化产生了主动防御机制即系统性获得抗性机制,从而避免各种外界伤害。从胁迫信号产生、应激反应发生到植物系统性抗性的产生,均需要一系列的信号转导。由于WRKY转录因子和病程相关蛋白PRs（Pathogenesis-related proteins）在植物抗病信号调控途径中起着重要作用,因此本研究以模式植物拟南芥为实验材料,对转录因子WRKY6和PR1（PATHOGENESIS RELATED,PR1）在转录水平响应生物及非生物胁迫应答模式进行研究。主要的研究工作及结果如下:1利用拟南芥eFP Browser数据库获得WRK和PR1基因的转录组数据,分析后得到WRKY6和PR1基因在不同生物及非生物胁迫条件下的表达热图,发现WRKY6和PR1基因在各种胁迫处理条件下具有相似又不同的表达模式。2 建立了丁香假单胞菌[Pseudomonas syringae pvtomato（Pst）DC3000]诱导拟南芥系统性获得抗性。实时荧光定量PCR结果显示,WRK和PR1尽管响应丁香假单胞菌处理的时间点不同,但WRKY6和PR1的mRNA水平都表现出一定的上升趋势。3经过植物激素水杨酸（SA）功能类似物BTH短暂处理后,WRKY6表达水平略有升高,而PR1的表达有显著升高。以BTH和水的组合处理在研究胁迫记忆（memory）应答机制的实验中,WRKY6表现出一定的胁迫记忆,而PR1表达没有显著变化,说明WRKY6和PR1基因在响应植物激素应答途径中的作用是相互独立的。外源应用茉莉酸（JA）能够诱导Thi2.1::GUS,在拟南芥根、下胚轴、分生组织、子叶等部位均有的差异性表达。4从突变体中筛选获得了响应茉莉酸信号途径的植物防御基因PDF1.2（Plant defensin1.2）的纯合T-DNA单突变体株系,为深入研究茉莉酸与水杨酸交叉途径的信号转导提供了实验材料。5非生物胁迫条件下,半定量RT-PCR结果显示WRKY6和PR1的表达在植物根、茎（地上部分）组织中表现出相对独立的模式。6通过Greengate克隆系统构建了35S::WRKY6-G 过表达载体,为进一步研究WRKY6调控的靶基因及信号通路奠定前期工作基础。总之,胁迫应答基因WRKY6和PR1在生物胁迫、非生物胁迫以及植物激素作用下,具有相似又相互独立的表达模式,表明其在植物胁迫反应中的调控功能具有复杂多样性,为今后深入探索植物“防御启动”和“记忆”机制提供了理论和实践支撑。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 拟南芥概述
•   1.2 生物与非生物胁迫
•   1.3 胁迫记忆 "Stress memory"
•   1.4 系统性获得抗性Systemic Acquired Resistance （SAR）
•     1.4.1 拟南芥-丁香假单胞菌系统
•   1.5 胁迫相关的植物激素
•     1.5.1 水杨酸
•     1.5.2 S-甲基苯并[1,2,3]噻二唑-7-硫代甲酸酯（BTH）
•     1.5.3 茉莉酸（Jasmonate acid,JA）
•     1.5.4 其它植物激素及其抗性
•   1.6 表观遗传记忆与植物防御
•   1.7 TrxG蛋白
•     1.7.1 TrxG蛋白的功能
•     1.7.2 TrxG蛋白中ATX1的作用
•   1.8 实验研究的目的和意义
• 2 拟南芥WRKY6和PR1基因响应生物胁迫处理的表达模式分析
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 植物培养
•     2.2.2 丁香假单胞菌Pseudomonas syringae（DC3000）培养
•     2.2.3 丁香假单胞菌处理
• 2） -假单胞菌处理'>    2.2.4 MOCK （MgCl₂） -假单胞菌处理
•     2.2.5 eFP Browser数据库WRKY6和PR1转录组数据分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 丁香假单胞菌诱导植物系统性获得抗性的菌落计数分析
•     2.3.2 拟南芥eFP Browser转录组数据库中WRKY6和PR1不同处理下表达模式的生物信息学分析
•     2.3.3 丁香假单胞菌处理后WRKY6和PR1基因表达分析
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 3 拟南芥WRKY6和PR1基因响应植物激素处理的表达模式分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 植物材料
•     3.1.2 实验试剂
•     3.1.3 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 植物培养
•     3.2.2 BTH处理
•     3.2.3 茉莉酸（JA）处理
•     3.2.4 茉莉酸（JA）标记基因PDF1.2纯合突变体筛选
•   3.3 结果分析
•     3.3.1 水杨酸的功能类似物BTH处理后WRKY6和PR1基因表达分析
•     3.3.2 JA诱导基因（Thi2.1）的染色分析
•     3.3.3 JA途径标记基因（PDF1.2）的纯合突变体筛选分析
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 4 拟南芥WRKY6和PR1基因响应非生物胁迫处理的表达模式分析
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 植物材料
•     4.1.2 实验试剂与仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 植物培养
•     4.2.2 非生物胁迫处理
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 非生物胁迫下WRKY6和PR1生物信息学分析
•     4.3.2 野生型在甘露醇胁迫处理下WRKY6和PR1基因半定量表达分析
•     4.3.3 野生型在盐胁迫处理下WRKY6和PR1基因半定量表达分析
•     4.3.4 野生型在UV-B胁迫处理下WRKY6和PR1基因半定量表达分析
•     4.3.5 野生型在冷胁迫处理下WRKY6和PR1基因半定量表达分析
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 5 AtWRKY6基因克隆及其表达载体构建
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 植物材料
•     5.1.2 菌株与载体
•     5.1.3 实验试剂
•     5.1.4 实验仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 目的基因片段扩增
•     5.2.2 目的基因片段凝胶纯化
•     5.2.3 目的基因片段酶切和去磷酸化
•     5.2.4 目的基因与空载体连接
•     5.2.5 DH5α大肠杆菌的制备以及转化
•     5.2.6 重组菌落的筛选及酶切鉴定
•     5.2.7 35S::WRKY6-GR过表达载体的构建
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 WRKY6基因CDS克隆
•     5.3.2 目的条带胶纯化结果
•     5.3.3 目的基因与载体连接结果分析
•     5.3.4 酶切检测分析
•     5.3.5 35S::WRKY6-GR过表达载体酶切
•   5.4 讨论
•   5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李爽

导师: 邢倩

关键词: 拟南芥,生物胁迫,非生物胁迫,植物激素,表达模式

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 东北林业大学

基金: 中央高校基本科研业务费专项资金(2572016DA03),黑龙江省科学基金项目(C2016007)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000781

总页数: 65

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