绒毛白蜡耐盐基因FvSnRK2的克隆及功能分析

论文摘要

环境胁迫影响着植物的生长、发育,而盐分胁迫是主要的非生物胁迫因子之一。盐分抑制植物的生长、制约农业的发展、对人类的生产和生活造成严重影响。植物在长期进化过程中逐步形成了一系列响应盐分胁迫的生理机制,其中植物激素脱落酸（ABA）就是其中一种非常重要的逆境激素,当植物受到多种胁迫时,例如:盐害、低温和干旱,植物细胞会迅速的积累ABA,响应逆境。SnRK2（sucrose non-fermenting1-related proteinkinases 2）是ABA信号通路中的下游信号的正调控者,在ABA响应胁迫的过程中,起着非常重要的作用。绒毛白蜡（Fraxinus velutina Torr）为木樨科、白蜡属的一种高大的落叶乔木,具有深根、侧根发达、适应性强、抗有害气体、抗病虫害、耐盐碱、耐涝等多种特点。是我国北方地区最抗盐碱的乔木树种之一,因此可将绒毛白蜡作为盐碱地区的绿化苗木,深入研究其耐盐机理对于大量推广应用此树种极为重要。转录组测序的结果表明,在盐胁迫（200 mmol/L NaCl）条件下,绒毛白蜡的耐盐基因FvSnRK2高度表达,推测FvSnRK2可能在植物耐盐过程中起关键作用,为此本试验克隆绒毛白蜡耐盐基因FvSnRK2,并在拟南芥中验证其功能,探究其耐盐机理。试验结果如下:1.利用生物信息学的方法以及分子生物学技术,从绒毛白蜡中获得两个编码SnRK2蛋白激酶新基因FvSnRK2182和FvSnRK5271。其中FvSnRK2182基因全长1773 bp,开放阅读框为1092 bp,其编码363个（10种）氨基酸残基,其中氨基酸所占比例较大的为:Ile、Asp、Glu、Leu;FvSnRK2182起始密码子序列为“GGTTGGATGGATCGACCGGC”,在N端有一个典型的Ser/Thr酶活结构域:“DFGYSKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPE”。FvSnRK5271基因,全长1267 bp,开放阅读框为1029 bp,其编码了343个（10种）氨基酸残基,其中氨基酸所占比例较大的为:Glu、Leu;FvSnRK5271起始密码子序列为“CAACAATGGATAGGTAC”,N端同样具有1个典型的Ser/Thr酶活结构域。生物信息学分析表明:FvSnRK2182和FvSnRK5271均属于SnRK2亚家族;两种蛋白三级结构均存在α-螺旋、β-折叠和β-转角等,均为亲水性蛋白。2.利用烟草瞬时转化法,用携带GFP和FvSnRK2182-GFP的构建体轰击烟草表皮细胞。通过双光子激光扫描共聚焦显微镜观察发现:GFP和FvSnRK2182-GFP融合蛋白在CaMV 35S启动子的控制下瞬时表达,发现FvSnRK2182定位于细胞膜和细胞核中,这与用花序浸染法将FvSnRK2182导入拟南芥,经Kan筛选后用双光子激光扫描共聚焦显微镜观察的结果一致。3.通过花序浸染法将FvSnRK2182导入拟南芥中,获得T0代的转基因种子。经过3代培养,筛选得到T3代过表纯合拟南芥植株,对其进行功能分析后发现:1)和野生型拟南芥相比,过表拟南芥植株的侧根数量明显增多;进一步分析发现,过表拟南芥植株在幼苗萌发和生长期间生长素含量一直保持较高水平;2)盐胁迫条件下,和野生型拟南芥相比,过表拟南芥株系的耐盐性显著提高,主要表现在种子萌发和幼苗生长方面;3)和野生型拟南芥相比,过表拟南芥株系对ABA更加敏感,表现在种子的萌发率、发芽势、发芽指数、主根长和侧根数明显降低;4)在NaCl和ABA共同处理条件下,和野生型拟南芥相比,过表拟南芥株系的抗性明显增加;5)在100 mmol/L NaCl处理条件下,和野生型拟南芥相比,过表拟南芥株系地上、地下干鲜重、地上叶绿素含量和K+含量明显增高,Na+含量和Na+/K+明显降低。4.转录组测序分析发现:1)和野生型拟南芥相比,过表植株有573个基因表达发生明显变化,其中246个基因上调、327个基因下调;这573个差异表达基因注释到37个GO分类中,其中包括15个生物学过程分类、12个细胞组分分类、10个分子功能分类;KEGG通路注释结果分析发现,过表植株的573个差异表达基因被注释到20个通路上,包括:信号转导、生物合成以及多种代谢;2)在盐处理48 h后,和野生型拟南芥相比,过表植株只有112个差异基因表达,其中65个基因上调、47个基因下调;这112个差异表达基因注释到38个GO分类中,其中包括16个生物学过程分类、12个细胞组分分类、10个分子功能分类;KEGG通路注释结果分析发现,112个差异表达基因被注释到20个通路上,包括:细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理以及代谢。这能够在基因层面上解释NaCl胁迫对过表拟南芥生长的影响;3)随机挑选了17个差异表达量高的基因,用实时荧光定量PCR（qPCR）验证了转录组结果的准确性;4)结合转录组测序结果,钙依赖性蛋白激酶途径中离子转运相关蛋白的基因表达情况是:100mmol/L NaCl处理条件下,野生型拟南芥HKT1、SOS1和AKT1表达下调,NHX1表达上调;与野生型拟南芥相比,过表拟南芥株系中HKT1、SOS1表达显著下调,NHX1和AKT1表达显著上调;ABA信号通路中SnRK2下游基因表达的情况如下:100 mmol/L NaCl处理条件下,与野生型拟南芥相比,过表拟南芥株系中KAT1和SLAC1表达显著下调,Rboh、ABF2、AREB4和ABF3表达显著上调。综上所述,本研究首次从绒毛白蜡中克隆得到了完整的FvSnRK2182激酶基因和FvSnRK5271激酶基因;FvSnRK2182基因在拟南芥根和叶中均有表达,同时受到盐胁迫的诱导;过表达FvSnRK2182基因明显促进侧根生长并提高了植株耐盐能力。这些结果初步表明FvSnRK2182参与抗逆相关生理过程,为进一步研究绒毛白蜡的耐盐机理奠定了基础。

论文目录

• 缩写词中英文对照表
• 中文摘要
• abstract
• 文献综述
•   1 引言
•     1.1 植物抗盐概述
•     1.2 ABA调节逆境及ABA信号通路
•     1.3 SnRKs家族简介
•     1.4 SnRK2 家族
•     1.5 绒毛白蜡（Fraxinus velutina Torr）介绍
•   2 论文的目的与意义
•   3 实验设计
• 第一章 绒毛白蜡耐盐基因FvSnRK2182和FvSnRK5271 全长的克隆与分析
•   1 试验材料
•   2 试验方法
•     2.1 RNA的提取
•     2.2 从总RNA合成第一链c DNA
•     2.3 基因全长的克隆
•   3 结果
•     3.1 基因分子水平分析
•     3.2 FvSnRK2182和FvSnRK5271 与其他物种进化树分析
•     3.3 FvSnRK2182和FvSnRK5271 与拟南芥进化树分析
•     3.4 FvSnRK2182和FvSnRK5271 的一级结构分析
•     3.5 FvSnRK2182和FvSnRK5271 的二级结构分析
•     3.6 FvSnRK2182和FvSnRK5271 的三级结构分析
•     3.7 FvSnRK2182和FvSnRK5271 的疏水性分析
•     3.8 FvSnRK2182和FvSnRK5271 的保守性分析
•   4 讨论
• 第二章 过量表达Fv SnRK2182和Fv SnRK5271 拟南芥纯合株系的筛选及亚细胞定位
•   1 试验材料与处理
•     1.1 试验材料
•     1.2 材料培养与处理
•   2 试验方法
•     2.1 过量表达载体的构建
•     2.2 拟南芥花序的侵染
•     2.3 绒毛白蜡耐盐基因的亚细胞定位和永久表达
•     2.4 卡那霉素筛选过表达株系
•     2.5 DNA 水平上鉴定过表达植株
•   3 结果
•     3.1 表达载体构建
•     3.2 亚细胞定位的表达载体构建
•     3.3 卡那霉素筛选过表达株系
•     3.4 亚细胞定位
•     3.5 亚细胞定位结果在拟南芥中验证
•     3.6 DNA分子水平上验证拟南芥纯合体
•   4 讨论
• 第三章 FvSnRK2182 在拟南芥中的功能研究
•   1 试验材料与处理
•     1.1 试验材料
•     1.2 材料培养与处理
•     1.3 软件与数据处理
•   2 试验方法
•     2.1 萌发试验
•     2.2 拟南芥幼苗主根长度及侧根数量的测定
•     2.3 拟南芥幼苗干鲜重的测定
•     2.4 拟南芥幼苗离子含量的测定
•     2.5 拟南芥幼苗叶绿素含量的测定
•     2.6 拟南芥幼苗激素含量的测定
•     2.7 生长素合成和运输相关基因的表达
•     2.8 NaCl处理条件下FvSnRK2182 的表达
•   3 结果
•     3.1 NaCl胁迫和ABA处理对拟南芥种子萌发生理的影响
•     3.2 Na Cl胁迫和ABA处理对拟南芥幼苗主根长度和侧根数的影响
•     3.3 NaCl处理对拟南芥幼苗干鲜重的影响
•     3.4 NaCl处理对拟南芥幼苗离子含量的影响
•     3.5 NaCl处理对拟南芥幼苗叶绿素含量的影响
•     3.6 过表FvSnRK2182 对拟南芥幼苗侧根的影响
•       3.6.1 过表FvSnRK2182 对拟南芥幼苗侧根数的影响
•       3.6.2 过表Fv SnRK2182 对拟南芥幼苗激素含量的影响
•     3.7 生长素合成和运输相关基因的表达
•     3.8 NaCl处理条件下FvSnRK2182 的表达
•   4 讨论
• 第四章 转录组测序分析
•   1 试验材料与处理
•     1.1 植物材料
•     1.2 材料培养与处理
•   2 试验方法
•     2.1 RNA的提取
•     2.2 拟南芥幼苗叶片c DNA的合成
•     2.3 实时荧光定量PCR验证
•     2.4 NaCl胁迫条件下,离子转运相关蛋白的基因表达
•     2.5 ABA信号通路中SnRK2 下游基因表达
•   3 试验结果与分析
•     3.1 数据分析
•     3.2 基因注释
•     3.3 组间基因表达结果
•     3.4 差异基因数量统计结果
•     3.5 差异基因GO数据库注释结果统计
•     3.6 KEGG通路注释结果统计
•     3.7 实时荧光定量PCR验证转录组数据的可靠性
•     3.8 NaCl胁迫条件下,离子转运相关蛋白的基因表达
•     3.9 ABA信号通路中SnRK2 下游基因表达
•   4 讨论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈春晓

导师: 陈敏

关键词: 绒毛白蜡,盐胁迫,转录组分析

来源: 山东师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,林业

单位: 山东师范大学

分类号: Q943.2;S792.41

总页数: 117

文件大小: 7625K

下载量: 69