乔燕1,2吴娟1赵胜男1朱潇潇1张兴德1,3,4(通讯作者)
谢辉1葛晓东4郁红礼1,3顾宁宁1
（1南京中医药大学药学院江苏南京210023）
（2徐州市铜山区郑集镇中心卫生院江苏徐州221143）
（3江苏省中药炮制重点实验室江苏南京210023）
（4南京中医药大学附属盐城市中医院江苏盐城224000）
【摘要】目的：采用正交试验法和单因素考察优选前列适安复方的最佳提取工艺。方法：以干浸膏得率、阿魏酸和黄芪甲苷含量为评价指标,考察加水量、煎煮时间、煎煮次数对水提工艺的影响；以干浸膏得率、淫羊藿苷含量为评价指标，考察乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数对醇提工艺的影响。结果：前列适安复方水提最佳工艺为加12倍量水，提取2次，每次1.5h；醇提最佳工艺为10倍量70%乙醇，提取1次，每次1h。结论：验证试验表明优选出的提取工艺稳定，合理，可行。
【关键词】前列适安复方；提取工艺；正交试验；单因素考察
【中图分类号】R94【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）21-0363-03
OptimizationofextractiontechnologyforcompoundQianlieancomplexbycomprehensiveevaluation
【Abstract】ObjectiveTooptimizetheextractionprocessofcompoundQianlieanbyorthogonaltestandsinglefactoranalysis.MethodsTheeffectsofwatercontent,decoctingtimeanddecoctingtimesonthewaterextractionprocesswereinvestigatedbytheyieldofdryextract,ferulicacidandastragalin,andtheeffectofethanolconcentration,alcoholconsumption,extractiontimeandextractiontimesonthealcoholextractionprocesswasinvestigatedwiththeyieldofdryextractandthecontentoficariinasevaluationindexes.ResultsThebestprocessofwaterextractionwas12timesofwaterextraction,2times,eachtime1.5h,andthebestprocessofalcoholextractionwas10times70%ethanol,and1times,1heachtime.ConclusionThevalidationtestshowsthattheoptimizedextractionprocessisstable,reasonableandfeasible.
【Keywords】Qianlieancompound;Extractiontechnology;Orthogonaltest;Singlefactorinvestigation
前列适安片为医院制剂，具有补肾强本，行淤导浊的功效。用于治疗老年前列腺增生排尿困难、前列腺痛等。该处方主要由黄芪、仙灵脾等14味药材组成，其中仙灵脾、仙茅为该制剂中君药。仙灵脾具有温肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功效[1]，所含的黄酮类、多糖及淫羊藿苷为主要抗炎活性成分[2]。仙茅具有温肾壮阳、祛寒除湿等功效[5]，可延缓生殖系统衰老、提高免疫力[6]。仙茅单体成分仙茅素A具有补肾壮阳作用[7]。综合考虑制剂成型工艺及临床疗效，通过查阅文献，将该方中的仙茅、仙灵脾等4味药材进行乙醇提取，黄芪、当归等7味药材进行水煎煮提取[8-10]。为确定合理的提取工艺，保证制剂质量和疗效，本实验以黄芪甲苷、阿魏酸及淫羊藿苷的含量作为评价指标，采用正交实验设计优化提取工艺参数，为进一步开发利用该处方提供参考。
1.仪器与试药
1.1仪器
美国Waterse2695高效液相色谱仪；电加热套（通州市申通电热器厂）；电热恒温热风干燥箱（DHG-9023A型，上海精宏实验设备有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-2型，国华电器有限公司）；超声波清洗器（KQ-500B型，昆山市超声仪器有限公司）；电子天平（JY1002型，上海浦春计量仪器有限公司）；挥发油提取器；1000ml圆底烧瓶。
1.2试药
本实验中所用的附子购自安徽孟氏中药饮片有限公司，其余药材均由徐州彭祖中药饮片有限公司提供，均符合2015年版《中国药典》相关项下规定。黄芪甲苷对照品（批号：MUST-17022804），阿魏酸对照品（批号：MUST-17010908），甲酸（批号：F1715004），淫羊藿苷对照品（批号：MUST-17051810）均为供含量测定用，购自成都曼斯特生物科技有限公司。液相用水为超纯水；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。
2.方法与结果
2.1水提工艺优选
2.1.1因素水平设计将黄芪、当归等7味药加水煎煮，以浸膏得率、黄芪甲苷和阿魏酸含量为评价指标，以加水量（A）、煎煮时间（B）、煎煮次数（C）为影响因素进行优化，因素水平表见表１。
2.1.2试验方法按处方比例称取附片、黄芪等共9份，按表1条件加水提取，其中附片先煎半小时，过滤，合并滤液，减压浓缩备用。
2.1.3干浸膏得率测定取滤液浓缩，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后置干燥箱60℃干燥至恒重，计算浸膏得率。
2.1.4色谱条件色谱柱为KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；蒸发光散射检测器检测；流动相：水-乙腈（60:40）；柱温：40℃；漂流管温度：100℃；气体流速：2.6L?min-1；进样量：10μl。以此色谱条件检测黄芪甲苷的含量。色谱柱为KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇-0.1%甲酸（45:55）；柱温为25℃；检测波长为320nm；流速为1ml?min-1；进样量为10μl。以此色谱条件检测阿魏酸的含量。
2.1.5对照品溶液的制备分别称取黄芪甲苷及阿魏酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，依次制成505μg/ml、416μg/ml的溶液，即得储备液。
2.1.6供试品溶液的制备取干浸膏粉0.5g，精密称定，加20ml水溶解，正丁醇振摇提取4次，每次40ml，用氨试液洗涤，取正丁醇液，蒸干，置5ml容量瓶中，加甲醇适量使溶解，摇匀，即得黄芪甲苷供试品溶液。取干浸膏粉1g，称定，置10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，称定重量，超声30min冷却后称定重量，甲醇补足减失重量，滤过，即得阿魏酸供试品溶液。
2.1.7标准曲线制备分别精密吸取“2.1.1”项下黄芪甲苷储备液和阿魏酸储备液1ml，用甲醇稀释至刻度，摇匀，重复操作5次，即得系列对照品溶液。精密吸取各对照品溶液10μl进样，按“2.1.2”项下色谱条件分别测定。以峰面积（y）为纵坐标，浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得黄芪甲苷和阿魏酸线性回归方程分别为y=12039x-278071（R2=0.9942），y=53518x-134044（R2=0.9998）。结果表明黄芪甲苷和阿魏酸浓度分别在7.9～505μg/ml、3.25～416μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.1.8样品含量测定分别精密吸取黄芪甲苷和阿魏酸对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
2.1.9正交试验及方差分析按正交L9（34）试验条件提取，共得到9份水提取液。依法测定黄芪甲苷、阿魏酸含量和干浸膏得率。结果见表2，方差分析见表3。黄芪甲苷和阿魏酸作为代表性成分的重要性大于浸膏含量。综合评价各因素对指标的影响，对于三个指标来说B2C2都是最佳水平组，A对于阿魏酸含量是最主要因素，而对于其他两个指标都是最次因素，所以选择A3为最佳水平。显著性水平取0.01，由方差分析得知除C因素对阿魏酸含量有显著影响外，其余因素对三指标并无显著影响。最终确定水提的最佳水平组为A3B2C2。
2.2.2试验方法按处方比例称取4味药材，按表4条件加对应浓度乙醇提取，其中车前子包煎，过滤，合并滤液，减压浓缩备用。
2.2.3醇提干膏得率测定取滤液浓缩，置已干燥至恒质量的蒸发皿中，水浴蒸干后置干燥箱60℃干燥至恒重，计算浸膏得率。
2.2.4色谱条件色谱柱为KromasilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；蒸发光散射检测器检测；流动相为乙腈－水（30:70）；柱温为35℃；检测波长为270nm；流速为1ml?min-1；进样量为10μl。
2.2.5对照品溶液的制备取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成492μg/ml的溶液，即得。
2.2.6供试品溶液的制备取2.2.3项下制得的干浸膏粉0.5g，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，甲醇补足减失重量，滤过，即得。
2.2.7标准曲线的测定精密吸取淫羊藿苷对照品溶液1ml，加甲醇1ml稀释，用甲醇稀释制备成标准品溶液。精密吸取10μl进样，按“2.2.4”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积（y）为纵坐标，浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=21187x-112840（R2=0.9994）。结果表明淫羊藿苷浓度在7.7～492μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.2.8样品含量测定分别精密吸取淫羊藿苷对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
2.2.9正交试验及方差分析按正交L9（34）试验条件提取，测定淫羊藿苷含量和干浸膏得率。结果见表5，方差分析见表6。综合评价各因素对指标的影响，B2对于两个指标都是最佳水平，D、C对于两个指标都是较为主要的因素，故选择D1C1作为最佳水平组，A对于淫羊藿苷含量这个指标是最次因素，但对于浸膏得率却是第二主要因素，故选择A2作为最佳水平。显著性水平取0.01，由方差分析得知三因素对指标并无显著影响。最终确定醇提工艺的最佳水平组为A2B2C1D1。
2.2.6验证试验称取处方量药材按优选的水提工艺进行试验，平行操作3份。结果平均浸膏得率9.83%，RSD为1.4%；淫羊藿苷平均含量为30.93mg/g，RSD为1.7%。表明优选的醇提工艺稳定可行。
3.讨论
本处方由十四味药组成，化学成分复杂，根据处方的功能主治结合有效成分的性质，选取浸膏得率和与功能相关的黄芪甲苷、阿魏酸、淫羊藿苷的含量作为评价指标，分别以正交试验法和单因素考察法优选最佳工艺。本实验选择合适的方法提取复方中药材的有效成分，以浸膏的形式入药，可以减少服用量。药材打粉后，出膏率和有效成分浓度比打粉前都有提高，但煎煮的药材不宜粉碎过细，否则会对试验结果产生影响。验证性试验结果表明该工艺条件具有可行性和实用性，为保证药效和质量提供了科学依据，也为前列适安浸膏片的开发应用奠定了基础。
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基金项目：江苏省中医药管理局立项资助