南极红球菌Rhodococcus sp.NJ-530 DNA光修复酶及其功能特性研究

论文摘要

光复活修复是生物体的一种重要的DNA损伤修复机制,对保持生物体遗传信息的延续性、遗传结构的完整性有重要作用。所谓光复活修复,是指在DNA光修复酶（photolyase）的作用下以光为驱动力来修复紫外线损伤的DNA。红球菌Rhodococcus sp.NJ-530是从南极冰水中分离出来的,携带光修复酶基因的细菌。由于长期生活在南极强紫外辐射、较低温度的环境,修复紫外造成的DNA损伤成为增强其生存机制的重要途径之一,因此,从分子水平上研究红球菌Rhodococcus sp.NJ-530光复酶修复作用是非常有意义的。此外,该研究也可以为南极细菌和其他南极物种应对强紫外辐射的生存适应性的研究提供基础。本论文主要进行了以下研究内容:通过聚合酶链式反应（PCR）和密码子优化合成红球菌Rhodococcus sp.NJ-530光修复酶基因PHR,并对PHR基因进行了生物信息学分析;应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对红球菌Rhodococcus sp.NJ-530光修复酶基因PHR的转录调控机制进行了研究;构建了光修复酶基因PHR的异源表达系统,实现了在大肠杆菌BL21（DE3）中的异源表达;利用Ni-NTA亲和层析对光修复酶进行纯化,获得纯度较高的目的蛋白;探究了PHR光修复酶在表达菌株中的修复活性和光修复酶的体外修复活性。本论文首次报道了红球菌Rhodococcus sp.NJ-530光修复酶基因PHR,cDNA全长为1146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为43.06KDa,并将该基因上传至GenBank,序列号是MH844561;qRT-PCR结果显示,在紫外光强为90μWcm-2和5℃温度条件下PHR表达量升高,说明PHR基因对紫外和低温度的胁迫较为敏感;聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western Blot分析表达的目的蛋白,其结果显示目的蛋白存在于细胞破碎液沉淀中,且分子量与预测分子量相同;通过实验分析得到PHR蛋白最佳表达条件为pH 7.0、IPTG作用浓度为0.5 mmolL-1、诱导温度为15℃,经验证,优化条件下目的蛋白的表达量与理论预测值基本吻合;将包涵体蛋白进行复兴、溶解操作后,进行Ni-NTA层析纯化,结果显示目的蛋白相对含量升高,杂蛋白含量减少;活性检测证明PHR光修复酶体内外活性良好,可以有效的修复紫外损伤的DNA。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
• 第一章 综述
•   1.1 光修复酶
•     1.1.1 光修复酶概述
•     1.1.2 光修复酶晶体结构
•     1.1.3 DNA光产物形成过程
•     1.1.4 DNA光修复酶修复DNA损伤原理
•     1.1.5 光修复酶应用现状
•   1.2 红球菌
•     1.2.1 红球菌分类
•     1.2.2 红球菌属特征
•     1.2.3 红球菌研究应用现状
•   1.3 本论文研究意义、内容及技术路线
•     1.3.1 研究意义
•     1.3.2 研究内容
• 第二章 南极红球菌Rhodococcus sp.NJ-530菌种鉴定及生长特性研究
•   2.1 材料与仪器
•     2.1.1 实验试剂
•     2.1.2 实验仪器
•     2.1.3 菌株来源
•   2.2 菌种鉴定
•     2.2.1 菌株形态观察
•     2.2.2 提取基因组DNA
•     2.2.3 基因组DNA电泳检测
•     2.2.4 16s rDNA PCR扩增
•     2.2.5 16s rDNA序列测定及分析
•   2.3菌体生长条件优化单因素实验
•     2.3.1 温度对菌体生长影响
•     2.3.2 pH对菌体生长影响
•     2.3.3 盐度对菌体生长影响
•   2.4 菌种鉴定结果
•     2.4.1 菌株形态鉴定结果
•     2.4.2 菌株在固体培养基中的生长状态
•     2.4.3 菌株16s序列扩增结果
•     2.4.4 同源性分析结果
•   2.5 细菌生长优化结果
•     2.5.1 培养温度对菌体生长的影响
•     2.5.2 培养基初始pH对菌体生长的影响
•     2.5.3 盐度对菌体生长的影响
•   2.6 讨论与分析
• 第三章 PHR基因克隆及分析
•   3.1 材料与仪器
•     3.1.1 菌种
•     3.1.2 培养方法
•     3.1.3 实验试剂
•     3.1.4 实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 RNA提取及检测
•     3.2.2 反转录合成cDNA
•     3.2.3 PHR基因片段扩增
•     3.2.4 目的片段纯化
•     3.2.5 PHR-T重组质粒构建
•     3.2.6 质粒转化
•     3.2.7 单菌落阳性检测
•     3.2.8 生物信息学分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 RNA提取
•     3.3.2 PHR基因片段验证
•     3.3.3 生物信息学分析
•   3.4 讨论与小结
• 第四章 胁迫条件下PHR基因表达调控
•   4.1 材料与仪器
•     4.1.1 实验试剂
•     4.1.2 实验仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 紫外胁迫诱导
•     4.2.2 温度胁迫诱导
•     4.2.3 总RNA提取及检测
•     4.2.4 反转录合成cDNA
•     4.2.5 定量引物设计
•     4.2.6 实时荧光定量PCR
•     4.2.7 数据处理
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 紫外胁迫下PHR基因的表达调控
•     4.3.2 温度胁迫下PHR基因的表达调控
•   4.4 讨论与小结
• 第五章 PHR基因异源表达
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验试剂
•     5.1.2 实验仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.0 PHR密码子优化
•     5.2.1 基因合成及生物学分析
•     5.2.2 质粒双酶切
•     5.2.3 PHR-pet32a质粒构建
•     5.2.4 质粒转化
•     5.2.5 单菌落阳性克隆检测
•     5.2.6 质粒提取
•     5.2.7 双酶切验证
•     5.2.8 PHR蛋白诱导表达
•     5.2.9 SDS-聚丙烯酰胺蛋白表达检测
•     5.2.10 Western-blot蛋白表达检测
•     5.2.11 目的蛋白质谱鉴定
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 PHR密码子优化
•     5.3.2 基因合成生物学分析
•     5.3.3 PHR-pet32a质粒酶切验证
•     5.3.4 SDS-聚丙烯酰胺蛋白检测
•     5.3.5 Western-blot蛋白检测
•     5.3.6 质谱鉴定结果
•   5.4 讨论与小结
• 第六章 PHR蛋白纯化及生物活性研究
•   6.1 材料与仪器
•     6.1.2 实验试剂
•     6.1.3 实验仪器
•   6.2 实验方法
•     6.2.1 大量诱导表达融合蛋白
•     6.2.2 超声破碎菌体
•     6.2.3 镍琼脂糖亲和层析
•     6.2.4 SDS-PAGE检测纯化蛋白
•     6.2.5 光修复酶体内活性研究
•     6.2.6 光修复酶体外活性研究
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 SDS-PAGE检测纯化蛋白
•     6.3.2 光修复酶体内活性
•     6.3.3 光修复酶体外活性
•   6.4 讨论与小结
• 第七章 构建PHR基因缺陷菌株
•   7.1 材料与仪器
•     7.1.1 实验试剂
•     7.1.2 实验仪器
•   7.2 实验方法
•     7.2.1 PHR同源臂克隆
•     7.2.2 ΔPHR-pK18mobsacB重组质粒获取
•     7.2.3 ΔPHR-pK18mobsacB重组质粒转化
•   7.3 结果与分析
•   7.4 讨论与小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 史崇丽

导师: 刘均洪

关键词: 光修复酶,基因,异源表达,酶活性分析

来源: 青岛科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 青岛科技大学

分类号: X172

总页数: 87

文件大小: 2727K

下载量: 85