线粒体电子传递链缺陷的小鼠胚胎干细胞系的构建

论文摘要

胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎的全能性细胞,它能够在体外无限制地增殖、分化,具有发育为完整个体的潜能。胚胎干细胞内表达Oct4、Sox2、Nanog等转录因子,这些调节因子形成了一个多能性调控网络,通过彼此调节表达水平来维持ESCs的多能性。线粒体代谢在干细胞命运决定中起着非常重要的作用,而我们前期的研究已经证明,线粒体稳态的维持对干细胞自我更新能力及多能性的维持起着非常关键的作用,但具体的调控机制还有待于进一步阐明。正常体细胞中,缺氧环境中线粒体靠糖酵解产生少量ATP,有氧条件下主要靠氧化磷酸化产生的ATP供能。而胚胎干细胞线粒体的供能方式及具体的机制还没有一个清晰的结论。复合体Ⅲ处于电子传递链的核心位置,它将复合体Ⅰ和复合体Ⅱ通过辅酶Q传递过来的电子继续向细胞色素c传递,同时将质子泵出线粒体内膜形成膜电势。TTC19作为线粒体复合体Ⅲ中一个重要的装配因子,对于复合体Ⅲ二聚体的形成至关重要,对线粒体电子传递与氧化磷酸化功能起关键的调控作用。我们以小鼠胚胎干细胞为研究对象,选取了线粒体复合体Ⅲ的装配因子TTC19作为靶标,来研究氧化磷酸化缺陷对于胚胎干细胞干性的维持有何影响。在本实验研究中,我们首先初步分析了小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞中线粒体的功能。与体细胞相比,胚胎干细胞氧化磷酸化与ATP产生之间是低耦联的,但是也具有完整的线粒体功能。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对Ttc19基因的外显子作为靶序列在网站上设计gRNA,构建pX330-gRNA-Cas9质粒,利用核转染技术将质粒转染到小鼠ESCs中。经过检测切割效率,我们选择效率最高的gRNA相对应的质粒去构建Ttc19基因敲除的小鼠ES细胞系。挑选单克隆后扩大培养,当细胞数足够时收集部分细胞提取其基因组DNA,扩增需要检测的靶序列及其上下游共约700bp大小的DNA片段,进行TA克隆后挑取单菌落送去测序。根据测序结果,选择有且只有两种编辑结果所对应的细胞系,即为我们需要的Ttc19敲除细胞系,核型检测显示为正常的二倍体核型。通过与野生型ESCs在能量代谢上的比较,证明Ttc19敲除ESCs的线粒体氧化磷酸功能受到了明显的抑制,同时对构建好的Ttc19敲除的ES细胞系进行自我更新能力检测、检测多能性基因在转录水平和蛋白水平的表达,我们发现其多能性也较野生型明显降低。此结果表明,敲除Ttc19基因造成胚胎干细胞的氧化呼吸链的缺陷会使其多能性降低。本研究中成功构建Ttc19基因敲除的ES细胞系,为进一步研究线粒体功能与干细胞命运调控的机制提供了重要的细胞模型。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 胚胎干细胞
•   1.2 线粒体代谢
•   1.3 TTC19
•   1.4 CRISPR/Cas9技术
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 主要试剂
•     2.1.2 质粒载体
•     2.1.3 主要细胞系
•     2.1.4 主要实验仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 分子克隆程序
•       1 PCR
•       2 DNA的纯化与回收
•       3 DNA回收片段及载体双酶切
•       4 目的片段和载体连接
•       5 转化到大肠杆菌感受态细胞中及菌落培养
•       6 质粒快速小量提取
•       7 酶切验证
•     2.2.2 pX330-eGFP载体构建
•     2.2.3 细胞培养
•       1 配制培养基
•       2 MEF细胞的原代培养与饲养层细胞（feeder）的制备
•       3 细胞冻存（以 100mm dish为例）
•       4 细胞复苏（以 100mm dish为例）
•       5 小鼠胚胎干细胞培养及传代（以6孔板为例）
•     2.2.4 pX330-gRNA-Cas9质粒切割效率检测
•       1 质粒大提
•       2 核转染
•       3 细胞分选
•       4 细胞DNA提取
•       5 目的基因上待检测片段PCR
•     2.2.5 构建Ttc19基因敲除的ES细胞系
•       1 质粒构建
•       2 核转染
•       3 挑取单克隆
•       4 细胞DNA提取
•       5 基因编辑区域PCR检测
•       6 目的条带测序
•     2.2.6 克隆形成能力检测与碱性磷酸酶显色（6 孔板为例）
•     2.2.7 实时荧光定量PCR （qPCR）
•       1 总RNA提取
•       2 反转录
•       3 qPCR
•     2.2.8 Western Blot
•     2.2.9 核型分析
•     2.2.10 Seahorse XF24分析
•       1 线粒体电子传递链与氧化磷酸化的耦联分析
•       2 线粒体电子传递流的分析
•       3 Ttc19基因敲除ES细胞系能量代谢检测
• 第3章 实验结果
•   3.1 小鼠ESCs与MEFs的线粒体功能比较
•     3.1.1 提取细胞线粒体
•     3.1.2 线粒体电子传递链与氧化磷酸化的耦联分析
•     3.1.3 线粒体电子传递流的分析
•   3.2 CRISPR/Cas9系统表达载体的构建及验证
•     3.2.1 gRNA设计与Cas9表达载体构建
•     3.2.2 Ttc19-gRNA效率验证
•   3.3 电子传递链复合体III缺陷的ESCs的构建
•     3.3.1 核转染并挑取ESCs单克隆
•     3.3.2 检测ESCs单克隆基因敲除
•     3.3.3 核型检测
•   3.4 Ttc19基因敲除ES细胞系能量代谢检测
•   3.5 Ttc19基因敲除ES细胞系多能性的检测
•     3.5.1 自我更新能力的检测
•     3.5.2 多能性基因转录水平表达情况检测
•     3.5.3 多能性基因蛋白水平表达情况检测
• 第4章 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 姚玉琛

导师: 杨月伟,赵同标

关键词: 胚胎干细胞,线粒体代谢,电子传递链

来源: 曲阜师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 曲阜师范大学

分类号: Q78

总页数: 48

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