家蚕BmCaspase-8-like的免疫负调控功能及作用机制研究

论文摘要

昆虫主要依赖于保守的先天免疫系统抵御病原微生物的入侵。昆虫的先天免疫包括体液免疫和细胞免疫。昆虫体液免疫主要依赖于两条NF-κB信号通路——Toll和IMD信号通路。当病原微生物入侵时,会激活NF-κB家族转录因子入核激活抗菌肽基因的表达。但若NF-κB信号通路被过度激活,则会导致昆虫寿命缩短、肠道菌群紊乱、神经退行性疾病等,因此免疫负调控分子的作用非常关键。大部分昆虫免疫负调控的研究仅限于果蝇,在其它昆虫中的相关研究较少,因此在鳞翅目模式昆虫家蚕上开展免疫负调控研究是有益的补充也是重要的拓展。本文针对家蚕体内鉴定到的新分子BmCaspase-8-like（BmCasp8L）进行了序列分析、结构域分析、进化分析、时空表达谱构建和免疫诱导表达谱分析,确定其具有免疫负调控分子的特征;通过个体和细胞水平的干涉和过表达证明了其负调控功能;通过Western blotting、ThT结合实验、共聚焦观察、半变性琼脂糖凝胶SDD-AGE检测及TUNEL染色、Co-IP等实验探讨了其作用机制。主要研究结果如下:1、BmCasp8L负调控家蚕免疫BmCasp8L与BmDREDD、DmDREDD以及人Caspase-8同源,氨基酸序列分析显示该分子序列与BmDREDD和DmDREDD N端序列分别具有61%、42%的相似性,结构域分析显示该分子包含两个串联DED结构域,但是缺少C端的Caspase结构域。5龄第3天家蚕幼虫的组织表达谱显示Bmcasp8l在免疫相关组织,例如脂肪体、血细胞中高量表达;预蛹期组织表达谱显示Bmcasp8l在丝腺中的表达量最高;时期表达谱显示Bmcasp8l在家蚕眠期的表达量显著高于起蚕期,在发育变态时期如预蛹期、蛹第7天、蛾第1天表达量升高。当家蚕受到黑胸败血芽孢杆菌（Bacillus bombyseptieus）和粘氏沙雷氏菌（Serratia marcescens）感染后,Bmcasp8l在1 h内表达量升高,而后逐渐恢复正常水平;细胞水平过表达Bmcasp8l,抗菌肽BmCecropinA1、BmCecropinB、BmAttacin的表达受到抑制,细胞水平干涉Bmcasp8l,抗菌肽BmCecropinA1、BmCecropinB、BmAttacin的表达水平升高;个体水平干涉Bmcasp8l,抗菌肽BmCecropinA1表达量升高。细胞和个体实验证明该分子负调控抗菌肽的表达。2、BmCasp8L通过与BmDREDD形成淀粉样蛋白纤维聚合物负调控IMD信号通路通过Western blotting检测BmIMD和BmRelish在BmCasp8L过表达情况下的切割水平,证明了BmCasp8L通过抑制BmDREDD对BmIMD及BmRelish的切割负调控IMD信号通路。TUNEL染色结果表明BmCasp8L能够抑制BmDREDD诱导的细胞凋亡。对凋亡细胞进行计数发现BmCasp8L对BmDREDD诱导的细胞凋亡的抑制作用具有剂量依赖效应。SDD-AGE、ThT荧光检测及共聚焦观察发现BmCasp8L在细胞内和体外都能形成淀粉样蛋白纤维聚合物,BmDREDD也能够单独形成淀粉样蛋白纤维聚合物。Co-IP实验及共聚焦观察发现BmCasp8L与BmDREDD形成淀粉样蛋白纤维聚合物,从而抑制了BmDREDD的活化,导致BmDREDD无法发挥功能。此外,共聚焦观察和SDD-AGE检测还发现,同样具有DED结构域的BmFADD则不能单独形成淀粉样蛋白纤维聚合物。当BmDREDD存在时,能够招募具有DED结构域的蛋白,如BmFADD和BmCasp8L,共同形成淀粉样蛋白纤维聚合物。当BmCasp8L存在时,也能与BmFADD共同形成淀粉样蛋白纤维聚合物,Co-IP实验进一步证明了BmCasp8L与BmFADD之间的相互作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 昆虫的先天免疫研究
•     1.1.1 体液免疫
•     1.1.2 细胞免疫
•   1.2 昆虫的抗病毒途径研究进展
•     1.2.1 RNAi途径
•     1.2.2 NF-κB信号通路
•   1.3 STING信号通路
•     1.3.1 cGAS-STING信号通路
•     1.3.2 昆虫STING信号通路
•   1.4 BmCaspase-8-Like的发现
•   1.5 IMD信号通路中负调控因子的作用机制
• 第二章 引言
•   2.1 研究背景及目的意义
•   2.2 研究内容
•   2.3 技术路线
• 第三章 BmCasp8L的功能研究
•   3.1 材料与试剂
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验仪器和试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 BmCasp8L的结构域预测和系统进化树
•     3.2.2 Bmcasp8l的时空表达谱和免疫诱导表达谱
•     3.2.3 细胞水平干涉和过表达BmCasp8L
•     3.2.4 个体水平干涉BmCasp8L
•   3.3 结果分析
•     3.3.1 BmCasp8L的结构域预测和系统进化树
•     3.3.2 Bmcasp8l的时空表达谱和免疫诱导表达谱
•     3.3.3 细胞水平过表达和干涉Bmcasp8l
•     3.3.4 个体水平干涉Bmcasp8l
•   3.4 讨论
• 第四章 BmCasp8L的作用机制研究
•   4.1 材料与试剂
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 实验仪器与试剂
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 BmIMD、BmFADD及 BmDREDD真核表达载体的构建
•     4.2.2 荧光蛋白融合载体的构建
•     4.2.3 BmCasp8L抑制BmDREDD对 BmIMD及 BmRelish的切割
•     4.2.4 BmCasp8L抑制BmDREDD诱导的细胞凋亡
•     4.2.5 BmCasp8L淀粉样蛋白纤维聚合物鉴定
•     4.2.6 BmCasp8L与 BmDREDD共同形成淀粉样蛋白纤维聚合物
•     4.2.7 BmDREDD招募DED蛋白共同形成淀粉样蛋白纤维聚合物
•   4.3 实验结果
•     4.3.1 BmIMD、BmFADD及 BmDREDD真核表达载体的构建
•     4.3.2 荧光蛋白融合载体的构建
•     4.3.3 BmCasp8L抑制BmDREDD对 BmIMD及 BmRelish的切割
•     4.3.4 BmCasp8L抑制BmDREDD诱导的细胞凋亡
•     4.3.5 BmCasp8L能够形成淀粉样蛋白纤维聚合物
•     4.3.6 BmCasp8L与 BmDREDD共同形成淀粉样蛋白纤维聚合物
•     4.3.7 BmDREDD招募DED蛋白共同形成淀粉样蛋白纤维聚合物
•   4.4 讨论
• 第五章 综合与讨论
• 参考文献
• 在读期间发表论文及参研课题
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 胡杰

导师: 王菲

关键词: 家蚕,负调控,淀粉样蛋白纤维聚合物

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 西南大学

分类号: Q965

总页数: 75

文件大小: 4847K

下载量: 70