一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

论文摘要

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM （proto-spacer-motif）位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 （SpCas9）编码氨基酸（1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR）改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 植物材料
•   1.2 实验试剂
•   1.3 CRISPR/Cas9密码子改造及优化
•   1.4 gRNA靶位点引物设计
•   1.5 Cas9/VQR-gRNA体外酶切活性检测
•   1.6 水稻转化
•   1.7 阳性植株鉴定
• 2 结果与分析
•   2.1 CRISPR/Cas9密码子优化
•   2.2 CRISPR/Cas9 PAM位点分布
•   2.3 CRISPR/Cas9载体改造
•   2.4 CRISPR/Cas9-VQR蛋白活性和体外酶切活性检测
•   2.5 转化植株的表型观察及突变位点检测
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 陈凯,孙国梁,宋高原,李爱丽,谢传晓,毛龙,耿帅锋

关键词: 定点突变,基因突变

来源: 作物学报 2019年06期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学

单位: 中国农业科学院作物科学研究所

基金: 国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08009-001)资助~~

分类号: Q78

页码: 848-855

总页数: 8

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