大肠杆菌mcr-1耐药性及传播特性的初步研究

论文摘要

自质粒介导的粘菌素耐药基因mcr-1发现以后,目前mcr-1基因在全球六大洲超过40个国家都有报道,且传播机制复杂。但是迄今为止,携带mcr-1的菌株在部分地区的流行情况,耐药性和传播特性仍不清楚,缺乏相应的研究数据。因此本研究针对这一空白,选取上海市某奶牛场养殖环境样品分离的90株大肠杆菌和上海市第一人民医院分离的900株肠杆菌科细菌进行mcr-1基因的筛查,并进一步分析mcr-1阳性菌株的耐药性和传播特性,以期为研究mcr-1基因的传播机制提供参考依据。本文主要研究内容及研究结果如下:1.一株携带mcr-1动物源大肠杆菌EC11的分离鉴定及耐药性分析为了解mcr-1基因在上海市畜牧养殖场的流行性及mcr-1阳性菌株的耐药情况,本研究采集上海市某奶牛场养殖环境（粪便、土壤和污水）的宏基因组样品,应用选择性培养基进行耐粘菌素大肠杆菌的初步筛选,并利用生化实验和16s rDNA做进一步验证。最后利用PCR方法检测宏基因组样品和分离的大肠杆菌携带mcr-1情况,并对mcr-1阳性大肠杆菌进行耐药表型和基因型的分析。结果表明,在奶牛粪便中均检出mcr-1基因,且从中分离鉴定出一株携带有mcr-1基因的大肠杆菌EC11。纸片扩散法和肉汤稀释法显示该菌对绝大多数抗生素表现为敏感,其中对粘菌素的MIC值为8μg/mL;且不携带其它耐药基因。本研究是首次在上海市某奶牛场发现mcr-1基因的报道,虽耐药性尚处于较低水平,但mcr-1在畜牧养殖业的出现仍需引起国内警惕和重视,应对mcr-1基因在畜牧养殖业的检出情况和携带该基因菌株的药物敏感性应进行持续监测和密切关注。2.mcr-1基因在大肠杆菌EC11中的传播特性研究为探究mcr-1阳性大肠杆菌EC11的传播特性,本研究利用多位点序列分型（MLST）技术对EC11分型,并通过文献检索对616株属于245个不同序列类型的mcr阳性大肠杆菌进行遗传进化关系分析;用质粒的接合转移实验验证mcr-1是否具有可转移性;在此基础上通过全基因组测序（WGS）进一步分析其潜在的传播机制。结果表明EC11属于ST278型,为首次报道mcr-1阳性大肠杆菌的序列类型。此外,应用eBURST和最小邻近树进行分析表明mcr阳性大肠杆菌种群具有高度的遗传多样性。接合实验表明mcr-1能够成功转移到C600,平均接合转移频率为4.6×10-5。WGS表明EC11包含一个携带mcr-1的属于IncX4型的质粒pEC11b,其上含有典型的接合转移部分,包括接合转移起始位点oriT-like、松弛酶基因、IV型伴侣蛋白和IV型分泌系统等;mcr-1基因上游含有启动子序列,以上元件均有助于mcr-1基因的传播扩散。本研究应用MLST和WGS技术,有助于提供数据,更深入地了解mcr-1基因的传播机制。3.临床分离肠杆菌科细菌中mcr-1的筛查,耐药性及传播特性研究为了解mcr-1基因在上海市临床样品中的流行情况和传播机制,本研究通过对2011-2015年间上海市第一人民医院分离的900株肠杆菌科细菌进行mcr-1基因的筛查。用肉汤稀释法测定mcr-1阳性菌的耐药性;用接合转移实验验证mcr-1是否具有可转移性;用PCR技术检测mcr-1的质粒类型和上下游的基因环境;用MLST判断mcr-1阳性菌的序列类型及遗传进化关系。结果表明共6株大肠杆菌携带mcr-1基因,其中对粘菌素的MIC为48μg/mL,对其它抗生素均显示出多重耐药表型,且均携带多种耐药基因;6株大肠杆菌全部接合成功,接合转移频率为3.92×10-36.25×10-8,与供体菌相比,接合子不仅呈现多种耐药表型和基因型,同时也均存在一种耐药表型或基因型增多或缺失的现象;6株mcr-1阳性接合子的质粒复制子分型为IncX4型和IncI2型两种,其上下游的基因环境多样,包括转座酶基因tnpA等;6株mcr-1阳性大肠杆菌属于不同的序列类型。本研究从上海市临床样品中筛查出的6株mcr-1阳性大肠杆菌,不仅呈现多重耐药性,且具有较复杂的传播机制,应引起足够的重视。综上,本文对上海市某奶牛场的养殖环境样品和某医院的临床样品进行mcr-1基因的筛查,最后在奶牛粪便中检出1株mcr-1阳性大肠杆菌菌株,在临床样品中检出6株mcr-1阳性大肠杆菌菌株。这7株大肠杆菌均显示出不同程度的耐药表型和基因型,但临床分离到的菌株耐药性更强;7株大肠杆菌均具有不同程度的接合转移能力,且遗传环境多样。本文结果为研究mcr-1的耐药性和传播特性奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩写词表
• 第一章 绪论
•   1.1 细菌耐药性
•   1.2 多粘菌素的耐药性问题
•     1.2.1 多粘菌素的发展史
•     1.2.2 多粘菌素的耐药机制
•   1.3 多粘菌素耐药基因mcr-1 的研究进展
•     1.3.1 mcr-1 的首次出现和流行情况
•     1.3.2 mcr-1 的结构和耐药机制
•     1.3.3 mcr-1 的多种衍生体
•     1.3.4 mcr-1 阳性菌的种类
•     1.3.5 mcr-1 阳性大肠杆菌的序列类型
•     1.3.6 mcr-1 所在质粒的多样性
•     1.3.7 mcr-1 与插入序列ISApl
•     1.3.8 mcr-1 与其它耐药基因共存
•     1.3.9 mcr-1 阳性菌耐药性
•   1.4 总结与展望
•   1.5 研究目的和意义
• 第二章 一株携带mcr-1 动物源大肠杆菌EC11 的分离鉴定及耐药性分析
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料与仪器
•     2.2.2 样品的采集
•     2.2.3 细菌的分离与纯化
•     2.2.4 细菌DNA的提取
•     2.2.5 大肠杆菌菌株的鉴定
•     2.2.6 mcr-1 和其它耐药基因筛查
•     2.2.7 药物敏感性实验
•   2.3 结果
•     2.3.1 大肠杆菌的分离鉴定
•     2.3.2 耐药基因筛查结果
•     2.3.3 药敏实验结果
•   2.4 讨论
•   2.5 小结
• 第三章 mcr-1 基因在大肠杆菌EC11 中的传播特性研究
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 菌株来源
•     3.2.2 质粒接合转移实验
•     3.2.3 接合子的药物敏感性实验
•     3.2.4 MLST分析流行性
•     3.2.5 全基因组测序分析传播机制
•   3.3 结果
•     3.3.1 接合转移实验结果
•     3.3.2 MLST结果
•     3.3.3 大肠杆菌EC11 的全基因组特征
•     3.3.4 携带mcr-1 质粒的基因组特征
•   3.4 讨论
•   3.5 小结
• 第四章 临床分离肠杆菌科细菌中mcr-1 的筛查,耐药性及传播特性研究
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 菌株
•     4.2.2 主要试剂
•     4.2.3 细菌的活化
•     4.2.4 DNA提取
•     4.2.5 mcr-1 基因检测
•     4.2.6 mcr-1 阳性菌多粘菌素耐药相关基因突变的检测
•     4.2.7 mcr-1 阳性菌株的耐药性
•     4.2.8 mcr-1 阳性菌株的质粒接合实验
•     4.2.9 mcr-1 阳性菌株质粒复制子分型
•     4.2.10 mcr-1 周围的遗传环境检测
•     4.2.11 mcr-1 阳性菌株的多位点序列分型
•   4.3 结果
•     4.3.1 mcr-1 基因携带情况
•     4.3.2 多粘菌素耐药相关基因的突变检测结果
•     4.3.3 mcr-1 阳性菌株的耐药性结果
•     4.3.4 mcr-1 阳性菌的接合实验及药敏实验结果
•     4.3.5 mcr-1 阳性菌的质粒分型结果
•     4.3.6 mcr-1 阳性菌的基因环境检测结果
•     4.3.7 mcr-1 阳性菌的多位点序列分型结果
•   4.4 讨论
•   4.5 小结
• 第五章 总结和创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间取得的科研成果
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 白凤佳

导师: 赵勇

关键词: 粘菌素,大肠杆菌,耐药性,传播机制

来源: 上海海洋大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 上海海洋大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27314/d.cnki.gsscu.2019.000320

总页数: 95

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