转录激活因子ATF2对伪狂犬病毒感染PK-15细胞的作用研究

论文摘要

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）是疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科中的重要成员。伪狂犬病是PRV引发的猪的重要传染病之一,对养猪行业造成了巨大的经济损失。目前伪狂犬病已被农业部列为优先防治的16种动物疫病之一。因此研究PRV复制、与宿主之间互作等过程对寻找治疗α-疱疹病毒的药物靶点、研制新型疫苗是十分必要的。本课题以伪狂犬病毒（PRV）为材料,系统地研究猪肾上皮细胞（PK-15）在PRV感染后的信号通路转导过程。应用iTRAQ联用LC-MS/MS技术获取宿主蛋白质磷酸化水平的全局动态并基于生物信息学全面分析PRV感染对PK-15蛋白质磷酸化的影响。应用siRNA敲低atf2等基因表达、抑制剂阻断MAPK Pathway（ERK、JNK、p38通路）信号传导、慢病毒gRNA表达系统及Cas9表达细胞系构建atf2基因缺失细胞系、超表达atf2完整型及69/71苏氨酸磷酸化位点突变型表达质粒等实验方法,研究atf2基因及MAPK Pathway对PRV复制的影响。期望从宿主磷酸化蛋白质组学入手,对PRV在PK-15中的增殖机制进行深入研究。该研究可以对寻找PRV增殖依赖的宿主基因、发掘治疗α-疱疹病毒潜在药物的靶点、研制新型疫苗提供一些重要指导意义。关于本课题涉及到的具体工作内容及研究结果如下:1.PK-15细胞iTRAQ磷酸化蛋白质组学分析以MOI=10的PRV感染PK-15细胞,2.5 h.p.i.提取细胞的总蛋白,应用iTRAQ定量技术检测宿主细胞蛋白质磷酸化情况,生物信息学方法分析鉴定到的结果。显著性差异分析显示,共鉴定到磷酸化肽段5723个,蛋白质2180个,按照Ratio>+/-1.2且P value<0.05筛选标准共筛选到差异蛋白810个,磷酸化水平上调1.2倍率的磷酸化肽段有678个,磷酸化水平下调0.83倍率的磷酸化肽段有603个。差异蛋白质KEGG Pathway富集分析显示:MAPK Pathway是显著性差异蛋白较多且富集程度最高的信号通路。2.组学数据的验证及atf2基因的初步筛选通过检测ATF2(pT69/pT71)及RSK2(pS378)蛋白质磷酸化水平对组学数据进行了验证。Western blotting结果与组学数据一致,说明组学数据的可靠性。进一步通过siRNA干扰及空斑形成单位测定（PFU）实验,检测MAPK Pathway中有差异磷酸化表达的sos、max、nfκb、rsk2、atf2基因对于PRV增殖过程的影响。实验结果显示,对照组PRV滴度为107.15PFU/mL,atf2基因下调表达时,PRV滴度为106.55PFU/mL,下调100.6.6 PFU/mL;rsk2基因下调表达时,PRV滴度为106.35PFU/mL,下调100.8 PFU/mL;结果显示atf2、rsk2基因下调表达时,对于PRV增殖有一定程度地抑制作用。3.抑制剂阻断MAPK Pathway信号传递对于PRV复制的影响为了进一步确定在MAPK Pathway中rsk2和atf2所涉及到的ERK和JNK、p38信号通路是否参与PRV增殖过程,研究中分别使用针对ERK和JNK、p38信号通路的特异性抑制剂U0126、SP600125、SB202190抑制或阻断对应通路中的信号传递。Western blotting实验检测抑制剂的阻断效果,结果显示:U0126可抑制ERK Pathway信号传递,对于RSK2蛋白磷酸化水平有明显下调作用;SP600125通过抑制JNK Pathway信号转导起到下调ATF2磷酸化水平的作用;SB202190无法通过阻断p38信号转导下调ATF2磷酸化水平;因此可知PRV对于atf2基因的激活作用主要依赖于JNK Pathway。使用紫外灭活病毒（UV-PRV）及活病毒（WT-PRV）激活ERK和JNK、p38信号通路,Western blotting实验显示用UV-PRV刺激不能引起其下游基因rsk2及atf2磷酸化水平增加,该结果表明ERK、JNK和p38信号通路的激活不依赖于PRV的结构蛋白。病毒滴度测定结果显示,对照组PRV滴度为107.67PFU/mL,SP600125处理组PRV滴度为107.61 PFU/mL;显示PRV在PK-15上的复制依赖于JNK Pathway信号转导途径。通过抑制剂SP600125抑制JNK Pathway信号传递在下调atf2磷酸化水平的同时会抑制PRV在PK-15上的复制。4.敲除atf2基因对PRV在PK-15细胞中复制的影响基于Cas9表达系统,通过慢病毒转导方法成功构建atf2基因敲除的Cas9PK-15细胞系。在此基础上,进一步验证atf2基因敲除对于PRV增殖的影响。通过对不同感染时间点进行病毒滴度测定,结果显示:12 h.p.i.时,在亲本细胞株Cas9 PK-15上PRV滴度为108.45PFU/mL;ATF2-/-1基因敲除细胞系上,PRV滴度为107.68PFU/mL,下调100.77PFU/mL;ATF2-/-4细胞系,PRV滴度为107.69PFU/mL,下调100.76PFU/mL。结果表明atf2基因不表达时,PRV在PK-15细胞上的增殖受到显著抑制。5.超表达atf2/atf2（T69A,T71A）基因对PRV在PK-15细胞中复制的影响为更明确PRV增殖是受ATF2蛋白质表达水平还是其磷酸化激活作用影响,研究中运用分子克隆及点突变实验技术构建pcDNA3.1-FLAG-EGFP、pcDNA3.1-FLAG-ATF2、pcDNA3.1-FLAG-mATF2（T69A,T71A）三种质粒。通过转染,对比同时上调ATF2蛋白水平及磷酸化水平和只上调ATF2蛋白水平对PRV复制的影响。病毒滴度测定结果显示:对照pcDNA3.1-FLAG-EGFP组PRV滴度为105.59PFU/mL,pcDNA3.1-FLAG-ATF2组PRV滴度为105.68PFU/mL,pcDNA3.1-FLAG-mATF2（T69A、T71A）组PRV滴度为105.57PFU/mL。结果表明PRV的增殖依赖于ATF2蛋白的磷酸化激活作用,ATF2磷酸化水平上调时可以促进PRV的增殖。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
•   引言
•   1.1 伪狂犬病毒（PRV）的分子生物学特性及预防现状
•   1.2 PRV在上皮细胞的复制过程及胞内寄生
•   1.3 转录激活因子ATF2 的生物学功能
•   1.4 蛋白质的磷酸化修饰及其组学研究进展
•   1.5 iTRAQ技术原理
•   1.6 课题研究的目的及意义
• 第2章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 载体、质粒、病毒、细胞、感受态
•     2.1.2 工具酶及主要化学试剂
•     2.1.3 培养基及其配制
•     2.1.4 Western blotting所用试剂
•     2.1.5 其它溶液
•     2.1.6 本研究中所用的核苷酸引物
•     2.1.7 本研究中所用的siRNA
•     2.1.8 主要实验仪器及设备
•     2.1.9 分子生物学分析软件
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 细胞培养
•     2.2.2 病毒毒株的扩大培养及保存
•     2.2.3 病毒滴度（PFU）测定
•     2.2.4 iTRAQ实验方法
•     2.2.5 脂质体转染
•     2.2.6 Trizol法提取细胞Total RNA
•     2.2.7 RNA的质量鉴定
•     2.2.8 反转录
•     2.2.9 SYBR Green I实时荧光定量PCR
•     2.2.10 粗提病毒基因组
•     2.2.11 Western blotting
•     2.2.12 PCR扩增
•     2.2.13 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
•     2.2.14 PCR产物的回收与纯化
•     2.2.15 PCR产物同源重组
•     2.2.16 重组质粒的鉴定及提取
•     2.2.17 CaCl2 化学感受态的制备
•     2.2.18 化学感受态转化
•     2.2.19 MTT法测定抑制剂的细胞毒性
•     2.2.20 慢病毒系统介导构建atf2 敲除Cas9 稳转细胞系
• 第3章 实验结果
•   3.1 iTRAQ定量鉴定PRV感染后PK-15 细胞磷酸化蛋白
•   3.2 PRV感染PK-15 后磷酸化蛋白质的生物信息学分析
•     3.2.1 聚类分析（Clustering）
•     3.2.2 GO分析
•     3.2.3 差异蛋白KEGG通路富集分析
•   3.3 Western blotting验证磷酸化蛋白质组学数据
•   3.4 MAPK Pathway中磷酸化差异表达蛋白的基因筛选
•     3.4.1 siRNA下调MAPK Pathway相关基因表达
•     3.4.2 siRNA下调MAPK Pathway相关基因表达对PRV复制的影响
•   3.5 抑制剂阻断atf2/rsk2 基因信号转导对PRV复制的影响
•     3.5.1 MTT法检测抑制剂的细胞毒性
•     3.5.2 抑制剂对ATF2/RSK2 蛋白磷酸化水平的抑制效果
•     3.5.3 PRV对 MAPK Pathway的激活作用及抑制剂的抑制作用
•     3.5.4 抑制剂阻断atf2/rsk2 基因信号转导对PRV复制的影响
•   3.6 敲除atf2 基因对PRV在 PK-15 细胞上复制的影响
•     3.6.1 慢病毒表达系统构建atf2 基因敲除Cas9 稳转细胞系
•     3.6.2 敲除atf2 基因对PRV在 PK-15 细胞上复制的影响
•   3.7 超表达atf2/atf2（T69A,T71A）基因对PRV复制的影响
•     3.7.1 atf2/atf2（T69A,T71A）表达质粒构建
•     3.7.2 atf2/atf2（T69A,T71A）表达质粒在PK-15 细胞中的表达
•     3.7.3 超表达atf2/atf2（T69A,T71A）基因对PRV复制的影响
• 第4章 讨论与结论
•   4.1 关于伪狂犬病毒（PRV）复制过程所存在的研究问题
•   4.2 转录激活因子ATF2 促进PRV在上皮细胞中的复制
•   4.3 转录激活因子ATF2 可能影响PRV潜伏到再激活的转换机制
•   4.4 结论
• 参考文献
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 姜芳芳

导师: 刘正飞

关键词: 疱疹病毒,伪狂犬病毒,磷酸化位点

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000401

总页数: 66

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