基于细胞融合开发双基因共敲除技术

论文摘要

哺乳动物细胞基因的敲除、插入以及基因表达的调节都可以借助基因编辑工具（例如锌指结构、转录激活因子样效应物、CRISPR/Cas9技术）实现。然而,尽管锌指结构和转录激活因子样效应物已经开始实现有针对性的基因编辑,但两者皆成本高且不易获取。与之相比,由Cas9蛋白介导DNA双链断裂为原理发展而来的CRISPR/Cas9技术更具优势。由于Cas9蛋白介导DNA双链断裂的效率很高,因此CRISPR/Cas9技术能够更精准的进行基因编辑,并且能够有效地缩短基因编辑周期、减少工作量、降低成本。基于以上现状,本研究借助CRISPR/Cas9技术构建了多个HEK 293衍生细胞株:PIGA-KO-Hyg-GFP细胞株、PIGKKO-BSD-BFP细胞株、FUT8-KO-Hyg细胞株、ST6GAL1-KO-BSD细胞株、FUT8-cr1-KOHyg细胞株以及ST6GAL1-cr1-KO-BSD细胞株,这些衍生细胞株为后续研究提供实验模型。已经分别敲除两个不同基因的两个单倍体酵母细胞经过配对和孢子形成,可以产生基因双敲除的酵母细胞。那么,动物细胞借助CRISPR/Cas9技术敲除某些基因,然后通过类似于构建基因双敲除的二倍体酵母体细胞的方式,有可能实现动物细胞基因的双敲除。多年前生物学家已经发现:不同种细胞间可以通过融合产生杂种细胞,从而获得具有多种目标表现型的细胞株。换言之,通过细胞融合技术也可利用现有细胞直接获得新型细胞株,而不必进行复杂而漫长的基因编辑工作。这是细胞融合的优势。一直以来,人们常以中国仓鼠卵巢细胞、海拉细胞等为模型进行细胞融合,但是以人类来源的人体胚胎肾细胞为模型进行研究对人类疾病的防治更具优势。本研究以HEK 293 PIGA-KO-Hyg-GFP细胞株和HEK 293 PIGKKO-BSD-BFP细胞株为模型构建了HEK 293 PIGA-KO-Hyg-GFP&PIGK-KO-BSD-BFP融合细胞株;对以HEK 293细胞株为亲本的细胞融合条件进行了优化,提高了细胞融合效率并通过优化后的方法以HEK 293 FUT8-KO-Hyg细胞株和HEK 293 ST6GAL1-KO-BSD细胞株为亲本构建了HEK 293 FUT8-KO-Hyg&ST6GAL1-KO-BSD融合细胞株,实验证明HEK293细胞株可进行融合且融合细胞株能够产生健康稳定的后代。基于某些科研或生产的要求,需要快速构建同时敲除多个基因的细胞株。但是至今相关研究尚未取得令人满意的结果。此外,细胞融合技术是获得具有双显性性状细胞株（如可表达绿色及蓝色荧光蛋白的HEK 293 PIGA-KO-Hyg-GFP&PIGK-KO-BSD-BFP融合细胞株）的快捷方法,却不能获得双隐形性状细胞株（如PIGA-PIGK-DKO细胞株）。当敲除不同基因的两种细胞发生融合时,由于基因的互补作用,原细胞因基因敲除而获得的性状成为隐形性状,不能再表现出来。因此本研究设计了一种通过现有的基因已敲除细胞获得基因双敲除细胞的方法,即结合细胞融合与CRISPR/Cas9技术获得双敲的HEK 293衍生细胞株。通过此方法,本研究以HEK 293 FUT8-cr1-KO-BSD细胞株和HEK 293 ST6GAL1-cr1-KO-Puro细胞株为亲本构建了FUT8-ST6GAL1-DKO细胞株。本研究成功地结合了细胞融合与CRISPR/Cas9技术并获得了双敲的HEK 293衍生细胞株,其在科研发展和工业生产方面的重要意义可归纳如下:（1）以HEK 293细胞株为模型进行细胞融合并获得成功,并将细胞融合效率提高到了8.8%,这为以HEK 293细胞株为模型开展的细胞融合相关研究提供数据参考;（2）结合细胞融合与CRISPR/Cas9技术开发构建双基因敲除型细胞的新方法,可以在现有基因敲除型细胞株的基础上直接构建基因多敲除细胞;（3）结合细胞融合与CRISPR/Cas9技术有效地缩短了获得同时敲除多个基因的细胞株所需时间,对科研的快速发展和工业产品的高效生产具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 CRISPR/Cas9 技术简述
•   1.2 酵母生命周期简述
•   1.3 细胞融合简述
•     1.3.1 细胞融合诱导剂——聚乙二醇
•     1.3.2 细胞融合诱导剂——灭活的日本凝血病毒颗粒
•   1.4 HEK293 细胞株简述
•   1.5 GPI简述
•     1.5.1 GPI的合成
•     1.5.2 GPI转移酶简介
•   1.6 糖类简述
•     1.6.1 糖链合成的相关酶之核心岩藻糖基转移酶
•     1.6.2 糖链合成的相关酶之唾液酸转移酶
•   1.7 研究意义和主要内容
•     1.7.1 研究意义
•     1.7.2 主要研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 细胞株和质粒
•     2.1.2 试剂、酶及抗体
•     2.1.3 培养基、溶液的配制
•     2.1.4 主要的实验仪器
•   2.2 实验操作
•     2.2.1 大肠杆菌感受态细胞制备
•     2.2.2 质粒构建
•     2.2.3 质粒提取
•     2.2.4 HEK293 细胞株瞬时转染
•     2.2.5 HEK293 细胞株稳定转染
•     2.2.6 动物细胞基因提取与扩增
•     2.2.7 细胞融合的实验操作
•     2.2.8 流式细胞分析
•     2.2.9 荧光镜检
•     2.2.10 核型分析
•     2.2.11 细胞生长活性检验
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 PIGA-KO-Hyg-GFP细胞株和PIGK-KO-BSD-BFP细胞株的构建与融合
•     3.1.1 PIGA-KO-Hyg-GFP细胞株和PIGK-KO-BSD-BFP细胞株的构建
•     3.1.2 PIGA-KO-Hyg-GFP& PIGK-KO-BSD-BFP融合细胞株构建
•   3.2 细胞融合条件优化
•     3.2.1 以PEG为融合试剂的细胞融合条件优化
•     3.2.2 以HVJ-E为融合试剂的细胞融合条件优化
•   3.3 FUT8-KO-Hyg细胞株和ST6GAL1-KO-BSD细胞株的构建与融合
•     3.3.1 FUT8-KO-Hyg细胞株构建
•     3.3.2 ST6GAL1-KO-BSD细胞株构建
•     3.3.3 FUT8-KO-Hyg细胞株和ST6GAL1-KO-BSD细胞株的融合
•   3.4 FUT8 基因和ST6GAL1 基因的共敲除
•     3.4.1 FUT8-CR1-KO-BSD细胞株和ST6GAL1-CR1-KO-Puro细胞株的构建及鉴定
•     3.4.2 FUT8-cr1-KO-BSD细胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro细胞株的活性分析
•     3.4.3 FUT8 和ST6GAL1 在FUT8-cr1-KO-BSD细胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro融合细胞株中的敲除效率
•     3.4.4 FUT8-cr1-KO-BSD细胞株和ST6GAL1-cr1-KO-Puro细胞株的融合及FUT8 和ST6GAL1 共敲除
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 论文发表情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 于鲁孟

导师: 藤田盛久

关键词: 细胞融合,基因敲除

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江南大学

分类号: Q78

DOI: 10.27169/d.cnki.gwqgu.2019.000119

总页数: 51

文件大小: 1908K

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