一、亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择（论文文献综述）
吴文山[1]（2020）在《草莓bZIP11和FaSigma转录因子克隆、表达和功能研究初探》文中进行了进一步梳理研究表明部分bZIP和Sigma家族的转录因子成员参与植物果实和器官的生长发育过程。本试验克隆得到的FabZIP11和FaSigma转录因子,根据生物信息学分析推测可能与光合同化产物在草莓体内的运输和分配有关。因此初步探究FabZIP11和FaSigma两个转录因子的功能,为以后探究草莓器官和果实在生长发育、成熟过程中的光合产物分配机制,草莓产量的提高和品质的提升提供了重要的理论依据和实际应用价值。本文以红颜草莓的果实为实验材料,根据前期转录组和代谢组的整合分析结果,克隆得到FabZIP11和FaSigma两个基因。对这两个基因进行生物信息学分析和功能预测。采用荧光实时定量PCR技术对红颜、章姬和甜查理三个品种草莓果实和叶的不同发育时期,不同部位茎的FabZIP11和FaSigma进行表达模式分析。同时检测了三个草莓品种不同发育时期果实、叶片和不同部位茎的糖、酸和叶绿素含量。构建过表达载体 pCXSN-Flag-FabZIP11和pCXSN-Flag-FaSigma。pCXSN-Flag-FaSigma 成功转化了拟南芥Col-0,并鉴定得到11株拟南芥转基因植株:构建构建过量表达载体PBI121-gfp-FabZIP11和PBI121-gfp-FaSigma,并转化了番茄幼苗10株,并注射了番茄和草莓果实进行功能验证。通过以上实验初步验证FabZIP11和FaSigma的基因功能。本实验取得以下主要结果:1、以红颜果实为实验材料,克隆的到一个bZIP和一个Sigma转录因子基因。进化树结果表明FabZIP11和AtbZIP11同源性最高,故命名为FabZIP11,另一个基因与葡萄RNA聚合酶类转录因子同源关系很近,命名为FaSigma。2、对FabZIP11和FaSigma在红颜、章姬、甜查理三个草莓品种不同发育时期果实、叶片和不同部位茎进行时空表达分析,发现FabZIP11和FaSigma基因在三个品种的叶的生长和果实的成熟过程中都呈明显下降趋势,只有红颜叶中FaSigma基因呈上升趋势。FabZIP11和FaSigma基因表达量在靠近植株母体匍匐茎中高于远端。3、检测了红颜、章姬和甜查理三种草莓果实、叶不同发育时期,和不同部位茎中糖、酸等光合同化产物与叶绿素含量的关系。结果发现,随着果实的成熟,可溶性固形物的含量不断增加。在叶片和果实的发育过程中,可溶性总糖的含量和可滴定酸含量也在不断上升,叶绿素含量在果实发育过程中呈减少趋势,在叶片发育过程中呈增加趋势。不同部位茎中的糖、酸含量都很低,无明显变化趋势。远离植株本体的茎叶绿素含量远高于靠近植株本体的茎。4、构建了过量表达载体pCXSN-Flag-FaSigma,并成功转化异源植物拟南芥,最终的到11株转基因植株。构建了过量表达载体PBI121-gfp-FabZIP11和PBI121-gfp-FaSigma,成功转化了异源植物番茄,获得了 10株转基因番茄苗。通过注射方法在番茄和八倍体草莓果实中过量表达FabZIP11和FaSigma基因,注射区域果实成熟受到明显抑制。RT-PCR结果发现,在注射区域FabZIP11和FaSigma基因表达上升了8-100倍和6-20倍,说明FabZIP11和FaSigma基因具有抑制番茄和草莓的成熟的功能。
候怡谣[2]（2020）在《紫花苜蓿MsHB7基因的克隆及功能分析》文中研究指明植物的生长和发育受到各种非生物胁迫因素的影响。干旱和盐胁迫下,植物的生长和生理功能会被影响。转录因子在植物对环境的适应方面起着重要的作用。其中,HD-Zip第I类亚家族主要参与植物对非生物胁迫的响应。本研究旨在从紫花苜蓿中克隆得到HD-Zip第I类亚家族基因MsHB7基因,并将其转入拟南芥和紫花苜蓿中,研究该基因的功能。主要研究结果如下:1.MsHB7基因的克隆与生物信息学分析通过同源克隆,获得了紫花苜蓿MsHB7基因,该基因编码245个氨基酸,并含有两个保守结构域:同源异形域和亮氨酸拉链。系统进化树分析表明MsHB7为HD-Zip I亚类转录因子。2.MsHB7基因的组织特异性表达对紫花苜蓿根、茎、叶和花组织中MsHB7基因的表达水平进行了检测,发现MsHB7基因在不同组织中均有表达,且在花中的表达量最高。3.MsHB7的亚细胞定位通过构建MsHB7基因的亚细胞定位载体,使MsHB7基因与GFP蛋白在烟草细胞中融合表达,结果表明MsHB7蛋白定位在细胞核上。4.MsHB7基因对拟南芥和紫花苜蓿的遗传转化构建植物超表达载体pBI121-MsHB7,分别转化拟南芥和紫花苜蓿,成功获得转基因阳性植株。5.转MsHB7基因拟南芥的耐旱性分析在干旱胁迫下,转基因株系与WT植株相比更为萎蔫,相对含水量更低,转基因株系在干旱胁迫下积累了更多的脯氨酸和丙二醛,这表明转基因株系对干旱更敏感,推测MsHB7基因可能负调控拟南芥对干旱的响应。利用qRT-PCR技术进一步分析了干旱胁迫下ATCAT1、ATDREB2A、ATLEA3、ATRD29A这4个基因的表达水平。结果显示处理之后ATCAT1、ATDREB2A、ATRD29A在转基因中的表达水平明显高于野生型,而ATLEA3的表达水平明显低于野生型,表明MsHB7基因可能调控这些抗逆基因的表达水平,从而调节植物的耐旱性。6.转MsHB7基因拟南芥的耐盐性分析在盐胁迫下,转基因株系同WT植株没有明显差异,推测MsHB7基因不参与拟南芥对盐胁迫的响应。
何青云[3]（2020）在《转录因子NbbZIP60在马铃薯Y病毒侵染中的调控作用》文中提出拟南芥AtbZIP60是未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）机制中的一个转录因子,具有调节植物生长发育的功能。高温、盐胁迫或病原物侵染,引起内质网应激,植物可启动UPR,激活需肌醇酶（Inositol requiring kinase 1,IRE1）介导的bZIP60 mRNA剪接激活机制,形成有活性的、进入细胞核发挥作用的截短形式蛋白,促进UPR相关基因的表达,减缓内质网应激,以重建细胞内稳态。马铃薯Y病毒（Potato virus Y）是烟叶生产上常见的病毒之一,侵染后降低烟叶产量和烤烟品质,生产上缺少靶向抗potato virus Y（PVY）药物。病毒介导的IRE1/bZIP60信号在烟草中尚未被阐释。本论文旨在研究本氏烟NbbZIP60信号如何调节生长发育过程,揭示NbbZIP60在PVY侵染过程中的作用机理,以期利用NbbZIP60提高植物抗病性和抗逆性,为靶向抗病毒提供理论依据。主要研究结果如下:（1）在本氏烟全基因组水平一共鉴定到79个NbbZIP转录因子,其中有59个在NCBI中有EST数据验证。NbbZIP转录因子都包含有一个bZIP结构域,结构域中第24位都为赖氨酸,说明赖氨酸是组成NbbZIP转录因子bZIP结构域的保守氨基酸;NbbZIP分为10个亚族,主要定位在细胞核中。（2）通过实时荧光定量PCR、激光共聚焦显微镜、透射电镜观察等方法证明NbbZIP60参与抑制PVY复制的过程。PVY侵染导致内质网结构和形态发生改变,编码内质网伴侣蛋白基因BLP4,UPR基因NbbZIP60、NbbZIP28上调表达,说明PVY侵染寄主,引起内质网应激,细胞启动UPR,缓解PVY增殖造成的负荷。PVY侵染可激活NbbZIP60跨膜域内mRNA发生碱基缺失,进而翻译出活性蛋白NbbZIP60S参与抵抗PVY的复制。（3）通过病毒介导的基因沉默（Virus-induced gene silencing,VIGS）技术、CRISPR/Cas9基因敲除技术和35S启动子过表达技术等方法对转录因子NbbZIP60在PVY侵染过程中的调控作用进行研究。沉默NbbZIP60,导致植株变矮,现蕾期推迟,加快PVY复制进程,有利于PVY侵染;NbbZIP60瞬时过表达,PVY复制进程减缓;说明NbbZIP60对PVY的复制起负调控作用,并在植物生长发育过程中起促进作用。由上述结果得出结论:NbbZIP60为PVY侵染胁迫下的UPR调控因子,在PVY侵染早期通过上调UPR相关基因NbbZIP60、Nbb ZIP28,提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的复制进程。PVY侵染促进NbbZIP60 mRNA剪接激活,产生活性蛋白NbbZIP60S进入核后调控植物抗病过程。NbbZIP60能减缓病毒的复制进程,但不能抑制病毒的系统性侵染。
钟宣伯[4]（2020）在《HD-Zip转录因子GmHdz4对大豆耐旱性影响的研究》文中认为大豆（Glycine max（L.）Merr.）是全世界人口植物蛋白质和油脂的主要来源,也是饲料蛋白来源之一,具有重要的经济价值并与国家粮食安全问题密切相关。气候的变化导致全球范围淡水资源逐渐匮乏,土地的干旱缺水已成为目前限制大豆产量最主要的因素。本研究运用反向遗传学手段,以野生大豆HD-Zip I转录因子Gshdz4核酸序列为参照,对栽培大豆基因组进行挖掘,获取到大豆中同源序列Glyma11g06940。在此基础上,对其核酸序列、蛋白质序列进行生物信息学分析,对其转录因子功能进行验证,对其在干旱胁迫响应中的作用机制进行探究,具体研究结果如下:1.蛋白质结构预测表明Glyma11g06940编码的蛋白序列与大豆HD-ZipⅠ亚族成员结构相似,具有同源异型域（HD）和亮氨酸拉链结构域（LZ）,属于HDZipⅠ亚族转录因子,并命名为GmHdz4;基因结构分析和进化树分析,进一步明确其分类地位属于δ亚组与野生大豆Gshdz4有直系同源关系;2.启动子预测结果表明GmHdz4启动子区域具有干旱响应元件和ABA响应元件;PEG模拟干旱、ABA诱导表达结果显示GmHdz4具有组织特异性表达的特点,且根系中的相对表达量与干旱程度或ABA处理时长呈负相关;3.烟草亚细胞定位实验确定了GmHdz4编码的蛋白定位于细胞核中;酵母双杂交实验表明GmHdz4具有作为转录因子的激活活性但不具有结合活性,是一个非典型的转录因子;4.利用发根农杆菌K599构建了大豆发状根系统,转化重组质粒得到过表达株系GmHdz4-oe、基因编辑株系gmhdz4,以非转基因株系NT为对照;5.过表达GmHdz4导致大豆发状根伸长、侧根数量受到显着抑制,影响了大豆根系的正常发育以及干旱胁迫下根系的形态学响应,并且对地上部分也产生关联影响;而敲除GmHdz4对根系生长有促进作用;6.过表达GmHdz4导致发状根大豆对干旱更为敏感,在渗透调节上表现出具有更早、更多可溶性糖和脯氨酸积累;并且该基因的过表达加重了干旱造成的根系损伤;7.过表达GmHdz4导致大豆发状根抗氧化酶活性受到抑制,SOD、POD、CAT抗氧化酶对干旱响应不敏感,而敲除GmHdz4转录因子提高了SOD、CAT等酶在干旱胁迫下的活性,促进了活性氧的清除。综上研究结果推测,转录因子GmHdz4可能对大豆的耐旱机制起负调控作用。这为后续对大豆HD-Zip转录因子的分子功能和抗旱机理的研究提供了理论支持,对耐旱大豆新品种选育工作有一定意义。
王猛[5]（2020）在《shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究》文中认为目的:1、研究肌动蛋白丝相关蛋白1相似蛋白1（AFAP1L1）在非小细胞肺癌（NSCLC）表达的临床意义。2、探讨shRNA沉默AFAP1L1对肺腺癌A549细胞增殖、细胞周期、凋亡和侵袭的影响,并初步探讨AFAP1L1参与调控肺癌发生进展的分子机制。3、通过构建慢病毒表达载体介导shRNA沉默AFAP1L1基因,观察其对肺癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用,为肺癌的基因治疗提供实验依据。方法:1、应用Max Vision免疫组化技术分别检测84例癌组织和69例正常组织中AFAP1L1蛋白的表达水平,分析AFAP1L1蛋白在癌组织和正常组织的表达差异及其与患者临床病理特征、病理分期的关系。2、利用shRNA干扰技术敲减肺腺癌细胞株A549中的AFAP1L1基因,抑制其在细胞内的转录翻译水平。随后使用Celigo图像细胞仪检测细胞增殖,应用流式细胞术评估细胞周期,以Annexin V（锚定蛋白）作为标记,测定细胞凋亡水平。通过Transwell实验研究AFAP1L1敲减肺腺癌细胞侵袭能力。进一步通过Path Scan细胞内信号转导阵列分析AFAP1L1敲减A549细胞的下游癌症信号蛋白。3、构建重组AFAP1L1基因的shRNA慢病毒表达载体。通过裸鼠成瘤实验体内验证AFAP1L1敲减对肺腺癌细胞增殖侵袭能力的影响。结果:1、通过Max Vision免疫组化法我们在84例NSCLC癌组织中检测62例AFAP1L1的不同程度表达（73.8%）,而在69例正常组织中仅检测到16例（23.2%）。AFAP1L1在NSCLC癌组织中高表达,在正常组织中低或无表达（χ2=38.84且P<0.005）,具有显着统计学差异。2、进一步分析发现,AFAP1L1的表达与肺癌病理分期相关。在I期、II期NSCLC患者组织标本中分别检测到53.8%和65.6%存在AFAP1L1的表达,而在III期+IV期NSCLC病人中AFAP1L1的表达率为88.5%。具有明显统计学差异（χ2=5.596且P<0.05）。3、AFAP1L1的表达水平与肺癌淋巴结转移、胸膜侵犯和脉管浸润相关。存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为85.1%,而不存在淋巴结转移的患者标本的AFAP1L1表达阳性率为62.2%。组间对比结果为χ2=4.653且P<0.05,存在统计学差异。有胸膜侵犯组和无胸膜侵犯组的阳性率分别为82.5%和61.4%,差异有统计学意义（χ2=4.416,P<0.05）。有脉管浸润组和无脉管浸润组的阳性率分别为82.1%和57.1%,有统计学差异（χ2=4.811,P<0.05）。此外,AFAP1L1蛋白的表达水平与患者的病理类型、性别、年龄无统计学差异（P>0.05）。4、成功构建AFAP1L1-shRNA慢病毒表达载体。研究发现敲低肺腺癌A549细胞AFAP1L1基因后明显抑制其增殖和侵袭能力;在细胞周期方面研究发现敲低AFAP1L1基因促进细胞周期向G1和G2/M期转变,G1和G2/M期细胞比例增加;与阴性对照的shRNA转染细胞相比,细胞凋亡在AFAP1L1-shRNA转染的细胞中的增加。Transwell测定结果显示,与空白对照组和质粒对照组相比,干扰实验组穿膜的细胞数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。使用Path Scan细胞内信号转导阵列分析,我们发现AFAP1L1的下调显着激活了P38和caspase3,并抑制PRAS40活化。5、利用活体成像技术通过裸鼠成瘤实验对移植瘤的生长情况分析显示,空白对照组、实验组肿瘤体积分别为:619.80±278.97mm3、289.50±47.07mm3,差异有显着性差异。空白对照组、实验组肿瘤重量分别为:0.966±0.185g、0.583±0.057g,实验组肿瘤重量明显低于空白对照组。此外,通过对实验组和空白对照组进行活体成像,结果显示相比空白对照组,实验组荧光表达量降低（P<0.05）。结论:1、AFAP1L1蛋白表达水平在NSCLC癌组织中显着高于正常组织,并且与NSCLC的病理分期、胸膜侵犯、淋巴结转移、脉管浸润密切相关,与性别、年龄、肿瘤类型无统计学意义。2、AFAP1L1加速肺腺癌细胞周期进程,抑制肺癌细胞凋亡,促进肺癌细胞的侵袭。3、RNA干扰作为一种高效基因编辑技术,可以沉默肺癌细胞目的基因的表达。构建稳定表达靶基因RNA干扰的慢病毒载体（shRNA-AFAP1L1-LVs）进行后续实验发现,于在体内外特异地抑制人肺癌细胞系中AFAP1L1基因的表达,可以抑制人肺腺癌细胞A549细胞株的生长增殖侵袭能力。利用活体成像技术,验证了沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞生物学行为的影响。为进一步研究肺癌细胞的恶性行为奠定基础,为揭示肺癌发生发展的分子机制提供更多证据,AFAP1L1有成为肺癌基因疗法中作用靶点的潜力。
刘婷婷[6]（2019）在《宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用》文中研究指明在真核细胞内,内吞体分选转运复合体（the endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）具有剪切脂质双层膜的功能,参与多泡体的形成、胞质分裂、质膜修复、核膜重构及囊膜病毒的入侵和出芽释放等多种生理代谢过程。已知,ESCRT复合体由ESCRT-0-III和Vps4等五个复合物以及一些辅助蛋白组成。其中ESCRT-0-II主要负责转运物的分选和囊泡的形成,而ESCRT-III则作为“剪刀手”直接参与囊泡的剪切释放。最后,Vps4水解ATP催化ESCRT-III复合物解离。杆状病毒是一类大分子双链DNA囊膜病毒。在感染周期中,杆状病毒通常产生两种类型的病毒粒子:出芽型病毒粒子（budded virions,BV）和包埋型病毒粒子（occlusion-derived virions,ODV）。近期的研究表明,过表达Vps4的显性-负性突变体（Dominant-negative,DN）显着降低苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV）感染性BV的入侵和出芽释放。然而,关于宿主细胞ESCRT复合体在AcMNPV感染中的作用尚不明确。在本研究中,我们从草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞Sf9中克隆了ESCRT-III关键组成基因Vps2B、Vps20、Vps24、Snf7、Vps46和Vps60。序列分析表明,草地贪夜蛾ESCRT-III各组分的同源基因广泛存在于已测序的昆虫基因组中。激光共聚焦分析表明,表达瞬时转染质粒的细胞中,融合GFP标签的ESCRT-III各组分与融合mCherry标签的Vps4突变体E231Q存在共定位,推测这些融合蛋白可能定位于细胞内吞体中。采用病毒缺失-补偿系统（瞬时转染病毒膜蛋白GP64的表达质粒拯救缺失gp64基因AcMNPV的复制）,我们发现过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分（DN突变体）显着减少进入宿主细胞的病毒粒子,并且进入细胞的病毒粒子大多数被束缚在细胞质中不能被有效转运至细胞核进行复制。进一步利用β-galactosidase与β-glucuronidase作为标记基因并结合定量检测病毒基因组DNA的复制来分析病毒基因的表达,我们发现过表达ESCRT-III组分显性-负性突变体显着抑制病毒复制的早期阶段。揭示宿主ESCRT-III复合物与AcMNPV入侵有关;为了避免表达ESCRT-III各组分的显性-负性突变体对病毒入侵的影响,我们把融合GFP的ESCRT-III各组分构建到AcMNPV基因组DNA（bacmid）中,然后转染Sf9细胞。在转染后24小时,收集细胞上清并分析感染性AcMNPV的产量。结果表明,过表达融合GFP标签的ESCRT-III各组分显着抑制感染性病毒的产量。透射电子显微镜分析表明,表达融合GFP标签的ESCRT-III组分蛋白Vps24与Snf7均能显着抑制子代病毒核衣壳从核膜释放,这些数据揭示ESCRT-III参与感染性AcMNPV出芽型病毒粒子的释放过程。由于AcMNPV出芽型病毒粒子的释放依赖于自身编码的一些蛋白（如Ac93:AcMNPV ORF93编码的蛋白）,我们选择Ac93作为目的蛋白进一步分析病毒蛋白与宿主ESCRT-III亚基及Vps4之间可能的相互作用关系。利用免疫共沉淀和双分子荧光互补分析发现,Ac93与ESCRT-III各组分及Vps4均存在相互作用。而Ac93与Vps4的两个突变体K176Q和E231Q之间存在的相互作用揭示Ac93与Vps4的相互作用并不依赖于其ATP酶活性。进一步分析表明,Ac93与另外两个参与子代核衣壳从核膜释放的病毒蛋白Ac76与Ac103之间存在相互作用。这些数据表明:Ac93可能与Ac76、Ac103、ESCRT-III及Vps4形成复合物参与调控BV的出芽释放过程。为了进一步明确Ac93与ESCRT-III亚基及Vps4的相互作用机制,我们首先对杆状病毒Ac93同源蛋白序列进行比对分析发现在Ac93的C-末端存在一个富含亮氨酸的MIM1-like模序,它可能参与Ac93与ESCRT-III亚基以及Vps4的相互作用。采用定点突变方法,我们构建了一系列由丙氨酸替换6个保守亮氨酸的单点或多点突变体。瞬时表达分析表明,丙氨酸替换亮氨酸不影响Ac93突变体的表达。免疫共沉淀与双分子荧光互补分析发现,丙氨酸替换单个或多个亮氨酸均不同程度降低了Ac93与ESCRT-III各组分、Vps4及病毒蛋白Ac76或Ac103的相互作用。同时,单个或多个位点突变均显着降低了感染性AcMNPV的产量及自带病毒核衣壳经核膜出芽释放效率及病毒诱导的核内微囊泡的形成。Vps4此外,由于AcMNPV的侵染依赖于宿主脂肪酸合成酶活性,为了探讨线粒体在杆状病毒侵染中的作用,我们初步获取了草地贪夜蛾（S.frugiperda）和粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）线粒体基因组序列,并进行了初步组装分析。总之,上述研究揭示宿主细胞ESCRT-III/Vps4参与AcMNPV的入侵和出芽释放过程,er而病毒自身编码的关键蛋白Ac93可能通过与病毒蛋白Ac76及Ac103互作形成复合体参与募集ESCRT-III/Vps4进而调控子代BV的出芽释放和ODV的组装。Vps4
陈芳[7]（2019）在《斑马鱼foxp3a和foxp3b的cDNA克隆及其在细菌免疫应答中的表达研究》文中认为调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg细胞）是一类CD4+T细胞亚群,能够控制体内自身免疫系统对机体造成的损伤。在Treg细胞分化和发育过程中以及维持功能稳定的过程中FOXP3（forkhead-box亚家族成员）发挥着重要功能。硬骨鱼类是同时具有获得性免疫和固有免疫的低等脊椎动物,具有和哺乳动物相类似的T、B淋巴细胞,对它们的研究对于理解免疫分子演化过程具有重要价值。目前大部分研究认为硬骨鱼类能够产生和哺乳类功能相似的Treg细胞,且已经相继从黑青斑河豚（Tetraodon nigroviridis）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鲑（Salmo salar）克隆得到了foxp3的同源分子的全长cDNA,并从斑马鱼（Danio rerio）中克隆了foxp3的同源分子的ORF序列（5’-UTR和3’-UTR为预测序列）。这些研究主要局限于mRNA水平和蛋白水平时空分布表达的研究,对FOXP3参与硬骨鱼类获得性免疫过程及其免疫应答变化情况研究较少。斑马鱼额外的染色体加倍事件导致存在两个拷贝的foxp3同源基因,即foxp3a和foxp3b,使得鱼类的Treg细胞及FOXP3研究变得更加复杂。为了丰富硬骨鱼类FOXP3研究,本研究首先构建了斑马鱼（Danio rerio）cDNA文库,采用RACE技术克隆得到斑马鱼foxp3a和foxp3b基因cDNA（含5’-UTR和3’-UTR）,并对其进行了生物信息学分析,在此基础上选择了斑马鱼foxp3a和foxp3b特异性片段分别构建了携带有HIS融合标签重组原核表达质粒,表达和纯化了重组融合蛋白,并制备了抗FOXP3A和FOXP3B的兔源多克隆抗血清,采用间接ELISA以及Western blot方法对多克隆抗血清进行验证。通过半定量PCR和整胚原位杂交技术（WISH）对斑马鱼foxp3a和foxp3b时空表达模式进行研究;另一方面,通过实时荧光定量PCR的方法,对腹腔注射嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）后斑马鱼肾脏中免疫因子的应答模式进行研究。主要实验结果如下:1)斑马鱼foxp3a和foxp3b的克隆结果表明,本研究成功克隆得到斑马鱼foxp3a和foxp3b基因cDNA。foxp3a基因的全长cDNA是1819 bp,其中开放阅读框长度为1260 bp,并编码一个由419个氨基酸组成的蛋白质;foxp3b基因的cDNA是1316 bp,其中开放阅读框长为1185 bp,编码394个氨基酸。蛋白预测结果显示斑马鱼FOXP3A和FOXP3B含有FOXP家族的特征性结构,即锌指结构和FKH结构域。多重序列比对结果显示,斑马鱼FOXP3A和FOXP3B氨基酸在锌指结构域、亮氨酸拉链结构域和FKH结构域高度保守。系统进化分析表明,斑马鱼FOXP3A和FOXP3B首先与鱼类聚为一类,其次与哺乳类聚为一支,提示斑马鱼FOXP3A和FOXP3B为哺乳动物FOXP3的直系同源分子。2)斑马鱼foxp3a和foxp3b时间表达模式的实验结果表明,斑马鱼foxp3a和foxp3b的表达水平随着受精卵的发育呈现出一定的规律性变化,foxp3a和foxp3b都是从12hpf开始表达,随着受精卵的发育,foxp3a的表达水平逐渐升高;24 hpf（hours post fertilization）时foxp3b表达量最高,之后随着斑马鱼胚胎的发育,foxp3b的表达水平又出现逐渐降低的趋势;组织表达模式的结果显示斑马鱼foxp3a和foxp3b基因分布广泛,在淋巴组织和非淋巴组织中均有表达;其次采用整胚原位杂交技术检测斑马鱼foxp3a和foxp3b在胚胎发育中的表达模式。分别选择foxp3a基因3’末端1415 bp和foxp3b基因3’末端615 bp的特异区段,反向克隆到pGEM-T-easy载体,成功构建了pGEM-T-easy-foxp3a和pGEM-T-easy-foxp3b原位杂交探针表达载体。体外合成地高辛标记的反义RNA探针。原位杂交结果显示,在胚胎发育至12 h时,foxp3a和foxp3b分布广泛,整个胚胎均有表达,随着胚胎发育逐渐集中到中胚层和头部。3)嗜水气单胞菌感染斑马鱼实验结果显示,在细菌感染过程中,斑马鱼肾脏中il-1β的mRNA表达量相对于PBS组均有显着升高（24 hpi,P=0.026;7 dpi,P=0.002）;感染组7 d比24 h的表达量相比显着降低（P=0.026）。foxp3a在细菌感染后24 h比对照组表达量显着升高（P=0.017）,感染组7 d比24 h的表达量相比显着降低（P=0.026）;foxp3b基因mRNA在细菌感染后24 h（P=0.675）和7 d（P=0.238）表达量相对于PBS组来说无显着性差异。4)本实验通过原核表达FOXP3A和FOXP3B部分片段的重组蛋白,经纯化后制备了多克隆抗血清。实验结果显示,在16℃,IPTG浓度为0.5 mmol/L,诱导10小时的条件下,SDS-PAGE结果表明,51.7 kDa的S-FOXP3A-HIS融合蛋白以包涵体形式大量表达,49.5 kDa的S-FOXP3B-HIS蛋白在上清中大量表达。ELISA检测显示,多克隆抗血清的效价均在1.6×105以上。进一步通过Western blot方法鉴定抗血清能否识别融合蛋白,研究表明,获得的多克隆抗血清能识别FOXP3A和FOXP3B融合蛋白。本研究一方面成功克隆了斑马鱼foxp3a和foxp3b的cDNA（含5’-UTR和3’-UTR）,并通过多种方法检测了多个组织中的mRNA水平表达模式,证实斑马鱼foxp3a和foxp3b不仅表达于淋巴样组织中而且还表达于非淋巴组织中。硬骨鱼类与哺乳类foxp3保守的mRNA水平表达模式提示其可能具有保守的生物学功能;另一方面,研究了嗜水气单胞菌感染的过程中,斑马鱼foxp3a和foxp3b基因在免疫应答过程中的表达情况,初步表明foxp3a可能是斑马鱼中有功能的同源分子,同时也提示在低等脊椎动物中foxp3可能在免疫中同样发挥了重要作用。另外,本研究制备的多克隆抗血清为今后更深入的研究斑马鱼FOXP3A和FOXP3B打下了基础。
杨慧[8]（2018）在《大豆子叶折叠突变体的基因初步定位、多组学数据分析以及相关基因的功能研究》文中研究指明大豆[Glycine Max（L.）Merr.]是世界重要的粮食和经济作物,也是人类和动物获取蛋白的主要来源。子叶是大豆种子胚的重要组成部分,其作用主要是在植株营养生长阶段供给幼苗养分。许多研究结果表明子叶在发芽后的生长状态直接影响着植株后续的营养生长和生殖生长,而植株整个生长周期的发育状态又与其抗性、产量和品质性状息息相关。因而,研究子叶发育缺陷型突变体对大豆育种和改良具有重要的意义。本实验室2002年通过NaN3-60Coγ诱变大豆栽培品种南农94-16（WT）获得了大豆子叶折叠突变体curled-cotyledon（cco）,其除了具有子叶向外折叠的特色表型外,还表现出其它农艺性状和品质性状的改变,包括:下胚轴变短,发芽率和株高降低,侧根根系减少,生育期延长,百粒重降低,以及蛋白质和氨基酸含量的提高。因此,与WT相比,cco突变体发生了很多性状的改变,且贯穿于整个生长周期中。本研究利用图位克隆的定位方法和高通量测序技术,对控制大豆子叶折叠的基因进行初步定位并进一步解析突变体内在的遗传变异,从而挖掘一些与大豆生长发育相关的基因。主要的研究结果如下:1.对大豆子叶折叠突变体cco进行种子、子叶形态、花粉活力和品质性状的调查,结果表明:与WT相比,cco种皮表面出现折痕,种子呈现两种形态（圆形和皱形）;子叶的贮藏细胞变宽,呈椭圆形,排列松散;且花粉活力降低;品质性状调查结果显示cco成熟种子中的蛋白质和多种水解氨基酸（包括含硫氨基酸）的含量显着提高,而油分含量显着降低。随后,构建cco与大豆科丰1号品种杂交的F2代群体,采用集团分离分析法（Bulk segregant analysis;BSA）及SSR分子标记辅助选择的定位方法,鉴定到2个可能控制大豆子叶折叠的位点,一个位于5号染色体上的BARCSOYSSR050037和Satt684标记之间,另外一个位于11号染色体上的Satt597标记附近。2.全基因组重测序数据分析结果显示,WT和cco间存在许多变异位点,其中SNP 有 120201 个,Indel 有 50228 个,SV 有 2231 个,CNV 有 16648 个,这说明 NaN3-60Coγ诱变WT后使其基因组发生了很大改变。序列变异位于基因上更容易引起编码蛋白的改变,因而对四种变异位于基因区域的基因进行统计,结果发现SNP位于基因区域的基因共有3339个,Indel有6704个,SV有5530个,CNV有1587个。GO和KEGG富集分析表明这些变异基因可参与许多不同的生物学过程,包括器官生长发育、胁迫响应和信号转导、物质合成及代谢过程等,因而推测这些不同变异基因可能直接或者间接参与cco的生长和发育。基于子叶折叠性状的基因初步定位结果,利用重测序数据在定位的5号染色体区段内找到3 1个变异位于基因区域的基因,这将为后期鉴定控制大豆子叶折叠的基因奠定一定的参考基础。3.利用全基因组甲基化测序技术分析cco的表观调控网络。结果显示,cco在基因组上发生甲基化的位点多于WT,但是其整体甲基化水平却低于WT。WT和cco之间共存在83366个显着的差异甲基化区域（DMR）,其中cco甲基化水平高于WT的区域共有38429个（hyper）,而cco低于WT的共有44937个（hypo）。在mCG、mCHG和mCHH三种甲基化类型中,mCHH类型在DMR中的数目最多,且其在染色体上的分布也最为密集。进一步分析位于差异甲基化区域的差异甲基化基因（DMG）,发现WT和cco间共有8905个显着的DMG。GO和KEGG富集分析显示这些DMG参与细胞功能调控、信号转导、生长发育、物质合成与代谢、胁迫响应和转运等等。利用甲基化测序数据在cco定位的5号染色体区段内共鉴定到了 47个差异甲基化基因,这些结果为甲基化可能调控子叶折叠突变体发育提供了新的参考。4.利用cco子叶折叠性状的基因初步定位结果与RNA-seq数据,筛选到一个在cco种子胚胎发育早期表达显着下调的基因Gmhdz20（Glyma.05G030000）并对其进行功能研究;甲基化测序结果显示Gmhdz20基因启动子区域的甲基化水平在cco中显着低于WT。Gmhdz20蛋白具有Homeobox结构域和亮氨酸拉链（leucine zipper）,属于 HD-Zip I（Homeodomain-leucine zipper）亚家族。组织表达结果显示Gmhdz20在大豆的不同组织中均表达,但是在叶片和子叶中的表达相对较高。亚细胞定位结果表明Gmhdz20是一个核定位蛋白。过表达Gmhdz20到拟南芥中改变了一系列表型,包括叶型、花型、分枝数、角果长度及种子分布排列。这些结果说明Gmhdz20可以同时参与调控植株的营养生长和生殖生长。利用酵母双杂技术在大豆叶片和英文库中筛选可能与Gmhdz20互作的蛋白,经回转验证发现有一个来源于叶片文库和两个来源于英文库的蛋白与Gmhdz20互作,它们分别是:编码泛素特异蛋白酶的基因Glyma.13G027600,homeobox基因Glyma.18G014900,以及编码α-葡萄糖苷酶的基因Glyma.04G123900。5.GmLBD12是一个可能参与cco根部发育的基因,且其对侧根的正向调控作用已在转基因拟南芥中被证明。因而,本研究对GmLBD12所属的LBD基因家族进行全基因组鉴定和表达分析。结果显示,大豆上共有90个LBD基因,其中41个基因有EST支持。与其它植物一致,大豆LBD基因在进化树上也形成两个亚家族（I和II）。大部分大豆LBD均匀分布在20条染色体上,并且有77个（81.11%）基因是片段复制基因,因而推测片段复制可能是大豆LBD基因扩增的主要原因。此外,GmLBD基因的基因结构和motif组成表明了它们在序列上的保守性。将90个大豆LBD基因与41个功能已知的植物LBD基因进行聚类进化分析,从而为大豆LBD基因的功能预测提供参考。电子表达数据和qRT-PCR结果显示有超过一半的大豆LBD基因能够表达,并且两个亚家族的基因具有不同的组织表达特征;除此,LBD基因还能响应不同的生物和非生物胁迫。
李婉影[9]（2018）在《玉米花丝特异性表达基因ZmbZIP25的转录调控和功能研究》文中研究表明玉米花丝是特化的柱头和花柱,直接参与授粉受精过程。为了利于花粉的粘附,并给花粉萌发提供足够的水分和营养,花丝表面细胞没有任何的防护,这也使病原菌的入侵有了可乘之机。玉米花丝为防御病原菌,存在一些花丝中特异性表达的基因。目前,关于玉米花丝特异性表达基因调控和功能研究的报道还很少。ZmbZIP25（Zea mays bZIP transcription factor 25）是bZIP类转录因子D亚族一个功能未知的蛋白。bZIP D亚族成员主要参与防御病原菌和植物发育两个不同的过程。转录组数据分析显示ZmbZIP25在玉米花丝中特异性表达,RT-PCR结果进一步证实了只在玉米花丝中有ZmbZIP25的表达。原位杂交显示仅在玉米花丝的木质部检测到ZmbZIP25 mRNA的积累。为了研究ZmbZIP25花丝特异表达的调控机制,首先通过5’RACE确定了 ZmbZIP25的转录起始位点。进而克隆了ZmbZIP25上游 2450 bp（-2083～+367）和 2600 bp（-2083～+517）片段（转录起始位点为+1）。拟南芥中稳定表达结果显示ZmbZIP25上游2450 bp可以驱动报告基因GUS在拟南芥柱头的乳突中特异性表达。同时,玉米中瞬时表达分析显示ZmbZIP25上游2450bp驱动的报告基因GUS和GFP仅在玉米花丝中表达,而在玉米其它组织,包括未成熟胚、苞叶、雌穗均未检测到报告基因的表达。然而,不管是拟南芥中的稳定表达还是玉米中的瞬时表达分析均显示ZmbZIP25上游2600 bp不能驱动GUS和GFP的表达。为了确定启动子中控制花丝特异表达的区段,对ZmbZIP25上游2450 bp进行缺失分析,分别缺失成1957 bp（-1590～+367）、1879 bp（-1512～+367）、1695 bp（-1328～+367）和 1484 bp（-1117～-957）时,均能驱动GUS基因在拟南芥柱头的乳突中特异性表达,而当片段缺失到1324 bp（-957～+367）时,报告基因不仅在拟南芥柱头的乳突中表达,还在幼苗、莲座叶和整个花器官中表达,即丧失了其启动的特异性。由此确定,ZmbZIP25上游-1117～-957的161 bp片段可能对ZmbZIP25的特异性起到关键的调控作用,推测在-1117～-957片段中可能存在抑制元件,抑制启动子在其它组织中表达。为研究ZmbZIP25的功能,从玉米自交系Mo17花丝中克隆了 ZmbZIP25基因,玉米原生质体亚细胞定位显示ZmbZIP25定位在细胞核中,符合其作为转录因子的基本特性。但是在酵母中,ZmbZIP25未显示出转录激活活性,且不与G-box、C-box和A-box元件结合。玉米叶片中,ZmbZIP25不受PEG、ABA、NaCl、MeJA和SA诱导表达。在拟南芥中异源表达ZmbZIP25,拟南芥表现出莲座叶变小、植株矮小且早衰的表型,ZmbZIP25表达量越高,株高矮小程度越严重。异源表达ZmbZIP25拟南芥中PR基因表达量上调。在玉米花丝中,ZmbZIP25受到MeJA上调表达,并且在1 h达到最高。将ZmbZIP25转化玉米植株中,转基因玉米出现植株矮小的表型,且随着ZmbZIP25表达量的提高,植株高度变小程度加剧。推测ZmbZIP25可能参与MeJA调控的植物抗病途径。
严闯[10]（2018）在《基于mNeonGreen和mNeptune的双分子荧光互补系统的研究》文中研究表明研究活细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用对于了解生命的活动过程具有重要意义。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）技术是近些年来发展起来的广泛应用于研究体内蛋白质互作及其定位的新技术。与酵母双杂交、蛋白质片段互补、生物发光共振能量转移、荧光共振能量转移等用于研究体内蛋白质相互作用的技术相比,BiFC技术具有灵敏度高、噪声低和易于操作等优势。但是,荧光蛋白生色团的缓慢成熟限制了 BiFC技术应用于细胞瞬时或动态相互作用的可视化研究。同时,目前已用于BiFC技术的荧光蛋白中也只有少数（Cerulean、Citrine、Venus等）可以在生理温度（37 ℃）下发生荧光互补,所以亟需发展新的BiFC系统。本研究基于Branchiostoma lanceoatumm来源的mNeonGreen蛋白发展了 一个迄今为止亮度最强且成熟时间最短的BiFC系统。mNeonGreen蛋白是由四聚体LanYFP蛋白改造而来的单体黄绿色荧光蛋白,其亮度比常用的绿色和黄色荧光蛋白亮1.5至3倍,且该荧光蛋白在37 ℃下的氧依赖性成熟时间是目前所报导的荧光蛋白中最短的（小于10分钟）。本研究首先根据mNeonGreen的基因序列通过密码子优化得到了人源化的mNeonGreen基因,再根据mNeonGreen的晶体结构将其分别从三个位点切开（Ala134-Asp135、158Asp-159Lys、Asn 173-Gly 174）,通过同向平行亮氨酸拉链（bFos和bJun）在HEK 293T细胞中筛选到Asn173-Gly174是最佳拆分位点,所形成的两个片段能够产生很强的荧光信号（另外两种拆分方式无荧光信号）,从而建立了基于mNeonGreen的BiFC系统。该系统缩短了 BiFC系统的响应时间,提高了 BiFC系统的灵敏度,有利于将BiFC技术应用于活细胞瞬时或动态相互作用可视化的研究。本研究的第二部分工作针对活体成像的“近红外（NIR）光学窗口（650-900 nm）”问题,深入研究并优化了波长较长（600/651 nm）且在37 ℃下成熟时间较短（T1/2≈28 min）的红色 BiFC 系统。本研究参照 mNeptune（600/651 nm）BiFC系统,对mNeptune二代（599/651 nm）荧光蛋白在同样的位点（155-156）进行了拆分,发现该系统荧光强度远弱于mNeptune 一代BiFC系统。于是对拆分后融合着相互作用蛋白的不同N肽段（bJun-N1、bJun-N2）和C肽段（bFos-C1、bFos-C2）进行了重新组合（bJun-N1+ bFos-C1、bJun-N1+ bFos-C2、bJun-N2+bFos-C1、bJun-N2+bFos-C2）。结果发现:重组后的 bJun-N1+bFos-C2BiFC 系统亮度最强,是原有mNeptune 一代BiFC系统（bJun-N1+ bFos-C1）亮度的两倍。为了探究荧光亮度提高的机理,体外纯化了 bJun-N1+bFos-C1和bJun-N1+bFos-C2蛋白,利用圆二色光谱测定其二级结构,结果表明这两种BiFC系统重构后的蛋白在二级结构上并无显着差异,因此该新的BiFC系统荧光强度提高的机理还有待于进一步的研究。此外,本研究还利用以上两种新建立的BiFC系统,针对被拆分后的荧光蛋白与相互作用蛋白（亮氨酸拉链）的融合方式进行了研究。结果表明,当以同向平行亮氨酸拉链bFos和bJun作为相互作用蛋白时,bJun-N+bFos-C的融合方式优于N-bJun+bFos-C及bJun-N+C-bFos的融合方式。该发现为bFos和bJun这对相互作用蛋白在BiFC系统中的应用提供了指导。
二、亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择（论文提纲范文）
（1）草莓bZIP11和FaSigma转录因子克隆、表达和功能研究初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 植物的光合作用 |
| 1.1.1 光合作用的研究现状 |
| 1.1.2 光合同化产物的运输与分配 |
| 1.2 植物bZIP转录因子家族的研究进展 |
| 1.2.1 bZIP转录因子结构与分布 |
| 1.2.2 植物bZIP转录因子的分类与功能 |
| 1.3 Sigma转录因子的分类与功能 |
| 1.4 植物bZ/P11和FaSigma转录因子的研究进展 |
| 2. 引言 |
| 2.1 研究的目的与意义 |
| 2.2 研究内容和技术路线 |
| 2.2.1 研究内容 |
| 2.2.2 技术路线 |
| 3. 试验材料和方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试植物材料 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 菌株和基因型 |
| 3.1.4 本文中用到的载体 |
| 3.1.5 本文中用到的抗生素 |
| 3.1.6 试验所用的药品试剂 |
| 3.1.7 实验过程所用试剂盒 |
| 3.2 实验操作方法涉及药品试剂 |
| 3.2.1 FabZIP11基因、FaSigma基因的克隆 |
| 3.2.2 FabZIP11/FaSigma基因的序列分析及亚细胞定位 |
| 3.2.3 目的基因的荧光定量 |
| 3.2.4 红颜、章姬、甜查理三种草莓不同时期果实和叶,以及不同部位茎生理指标测定 |
| 3.2.5 FabZIP11、FaSigma基因的转基因功能验证 |
| 3.2.6 农杆菌渗滤法转化草莓和番茄果实 |
| 4. 结果与分析 |
| 4.1 果实总RNA的提取 |
| 4.2 FabZIP11和FaSigma基因的结果与分析 |
| 4.2.1 基因的克隆与序列分析 |
| 4.2.2 FabZIP11和FaSigma保守结构域预测 |
| 4.2.3 系统进化树分析和蛋白序列对比 |
| 4.2.4 FabZIP11/FaSigma蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.3 FabZIP11/FaSigmia在红颜、章姬、甜查理不同发育时期果实和叶,茎的不同部位时空表达模式分析 |
| 4.3.1 FabZIP11/FaSigma果实发育期表达模式分析 |
| 4.3.2 FabZIP11/FaSigma在叶发育时期表达模式 |
| 4.3.3 FabZIP11/FaSigma在不同部位茎的表达模式 |
| 4.4 红颜、章姬、甜查理三种草莓不同时期果实和叶,以及不同部位茎生理指标的测定 |
| 4.4.1 果实可溶性固形物的比较 |
| 4.4.2 总糖含量的比较 |
| 4.4.3 可滴定酸含量的比较 |
| 4.4.4 叶绿素含量的比较 |
| 4.5 FabZIP11和FaSigma异源表达功能验证 |
| 4.5.1 pCXSN-Flag-FabZIP11、pCXSN-Flag-FaSigma基因过表达载体的构建 |
| 4.5.2 FabZIP11和FaSigma基因过量表达载体转化拟南芥 |
| 4.5.3 PBI121-gfp-FabZ/P11、PBI121-gfp-FaSigma基因过表达载体的构建 |
| 4.5.4 PBI121-gfp-FabZIP11、PBI121-gfp-FaSigma基因遗传转化Micro-Tom番茄 |
| 4.6 注射法转化Micro-Tom番茄和草莓果实基因功能验证 |
| 4.6.1 注射法转化Micro-Tom番茄果实基因功能验证 |
| 4.6.2 注射法转化草莓果实基因功能验证 |
| 5 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）紫花苜蓿MsHB7基因的克隆及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 HD-Zip类转录因子研究进展 |
| 1.2.1 HD-Zip转录因子的基本结构特征与分类 |
| 1.2.2 HD-Zip转录因子的功能研究 |
| 1.3 本课题的研究目的和意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 第2章 紫花苜蓿MsHB7基因的克隆及序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器及药品 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 MsHB7基因的生物信息学分析 |
| 2.4 MsHB7基因的组织特异性表达 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 MsHB7基因的克隆 |
| 2.5.2 生物信息学分析 |
| 2.5.3 MsHB7基因的组织特异性表达 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 MsHB7的亚细胞定位分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器与药品 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 表达载体的构建 |
| 3.3.2 烟草瞬时转化 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 表达载体的构建 |
| 3.4.2 亚细胞定位分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 MsHB7基因的遗传转化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 .实验药品 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 超表达载体的构建 |
| 4.3.2 农杆菌GV3101和EHA105的转化和鉴定 |
| 4.3.3 对拟南芥的遗传转化 |
| 4.3.4 转基因苜蓿的遗传转化 |
| 4.3.5 转基因拟南芥和紫花苜蓿的阳性鉴定 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 表达载体的构建 |
| 4.4.2 转基因拟南芥鉴定 |
| 4.4.3 转基因紫花苜蓿的遗传转化及鉴定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 转MsHB7基因拟南芥的抗逆性分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 植物材料 |
| 5.2.2 实验药品和仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 干旱胁迫下转MsHB7基因拟南芥的耐旱性分析 |
| 5.4.2 盐胁迫下转MsHB7基因拟南芥的耐受性分析 |
| 5.4.3 干旱胁迫下转基因拟南芥抗逆相关基因的表达分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 HD-Zip I转录因子在非生物胁迫下的特异响应 |
| 6.2 MsHB7基因的克隆及表达分析 |
| 6.3 MsHB7基因的转化和功能分析 |
| 6.4 对后续工作的展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）转录因子NbbZIP60在马铃薯Y病毒侵染中的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 马铃薯Y病毒在植物体内的复制过程 |
| 1.2 植物中的内质网应激和未折叠蛋白反应 |
| 1.2.1 内质网应激 |
| 1.2.2 未折叠蛋白反应 |
| 1.3 植物bZIP类转录因子的结构 |
| 1.4 植物bZIP60调控抗病和抗逆机制的研究进展 |
| 1.4.1 IRE1 介导的bZIP60mRNA非常规剪切及内质网伴侣蛋白BiP |
| 1.4.2 bZIP60的结构分析 |
| 1.4.3 bZIP60在细胞核内上调胁迫应答相关基因 |
| 1.4.4 调控bZIP60剪切激活的胁迫因素 |
| 1.4.5 IRE1/bZIP60信号在作物抗逆/抗病中的作用 |
| 1.5 本文研究意义 |
| 1.6 本文研究内容 |
| 第二章 NbbZIP转录因子的鉴定、NbbZIP60的克隆与序列分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 NbbZIP转录因子的鉴定 |
| 2.1.1.1 数据获取 |
| 2.1.1.2 NbbZIP转录因子的筛选和鉴定 |
| 2.1.1.3 系统进化、基因结构与保守序列分析 |
| 2.1.2 NbbZIP60的克隆与序列分析 |
| 2.1.2.1 材料 |
| 2.1.2.2 方法 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 NbbZIP转录因子的鉴定及理化性质 |
| 2.2.2 多序列比对和系统进化分析 |
| 2.2.3 NbbZIP60的克隆与序列分析 |
| 2.2.3.1 NbbZIP60的克隆 |
| 2.2.3.2 NbbZIP60结构分析 |
| 2.2.4 讨论 |
| 第三章 PVY侵染后NbbZIP60的表达特征分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 浸润PVY-GFP侵染性克隆 |
| 3.1.2.2 机械摩擦接毒 |
| 3.1.2.3 qRT-PCR检测UPR相关基因及PVY相对积累量 |
| 3.1.2.4 蛋白提取及Western Blot检测PVY |
| 3.1.2.5 激光共聚焦观察内质网形态变化 |
| 3.1.2.6 透射电镜观察内质网结构变化 |
| 3.1.2.7 激素处理后NbbZIP60的表达特征 |
| 3.1.2.8 PVY侵染激活NbbZIP60mRNA发生非常规剪接的验证 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 PVY在本氏烟中的侵染路径 |
| 3.2.2 PVY侵染上调UPR基因的表达 |
| 3.2.3 PVY侵染诱导内质网形态改变 |
| 3.2.4 PVY侵染导致内质网结构改变 |
| 3.2.5 水杨酸和茉莉酸上调NbbZIP60的表达 |
| 3.2.6 PVY侵染激活NbbZIP60mRNA发生非常规剪接的验证分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 PVY在本氏烟中的侵染路径 |
| 3.3.2 PVY侵染后NbbZIP60的表达特征分析 |
| 第四章 NbbZIP60对PVY致病力的调控 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.1.2.1 沉默NbbZIP60基因 |
| 4.1.2.2 敲除NbbZIP60基因 |
| 4.1.2.3 瞬时过表达NbbZIP60 |
| 4.1.2.4 过表达NbbZIP60突变体的构建 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 NbbZIP60对PVY的侵染起负调控作用并调节本氏烟发育 |
| 4.2.1.1 NbbZIP60沉默片段的扩增 |
| 4.2.1.2 沉默NbbZIP60后的植株表型分析 |
| 4.2.1.3 沉默NbbZIP60降低了寄主对PVY的防御能力 |
| 4.2.2 NbbZIP60基因敲除突变体的构建 |
| 4.2.3 过表达NbbZIP60减缓PVY的复制进程 |
| 4.2.4 NbbZIP60过表达突变体的构建 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 5.1 本文结论 |
| 5.2 本文创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）HD-Zip转录因子GmHdz4对大豆耐旱性影响的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干旱对植物的影响及作物耐旱机制的研究进展 |
| 1.1.1 干旱对植物的影响 |
| 1.1.2 植物对干旱胁迫调节的研究进展 |
| 1.1.3 响应干旱胁迫的相关分子机制 |
| 1.2 植物HD-Zip转录因子 |
| 1.2.1 HD-Zip转录因子的结构和分类 |
| 1.2.2 HD-ZipⅠ亚家族响应干旱胁迫的研究进展 |
| 1.3 大豆发状根系统的研究进展 |
| 1.4 野生大豆遗传资源的利用 |
| 1.5 本研究的主要内容与研究意义 |
| 第二章 GmHdz4的表达模式及生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂耗材与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 GmHdz4生物信息学分析 |
| 2.2.2 荧光定量PCR检测GmHdz4 相对表达量 |
| 2.2.3 数据处理 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 大豆GmHdz4序列的获取 |
| 2.3.2 大豆HD-ZipⅠ蛋白相似性分析 |
| 2.3.3 大豆HD-ZipⅠ基因结构分析 |
| 2.3.4 GmHdz4系统进化树分析 |
| 2.3.5 GmHdz4启动子分析 |
| 2.3.6 GmHdz4组织表达模式分析 |
| 2.3.7 干旱胁迫及ABA诱导大豆根系GmHdz4 表达模式分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 GmHdz4转录因子功能鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 载体与菌株 |
| 3.1.3 酶与引物 |
| 3.1.4 主要试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 栽培大豆GmHdz4 CDS的克隆及验证 |
| 3.2.2 大肠杆菌DH5α感受态制备 |
| 3.2.3 重组载体的构建 |
| 3.2.4 质粒提取 |
| 3.2.5 亚细胞定位 |
| 3.2.6 酵母双杂交 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 重组载体验证结果 |
| 3.3.2 GmHdz4烟草表皮亚细胞定位 |
| 3.3.3 GmHdz4酵母双杂体系转录自激活活性鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 大豆发状根系统的构建 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 载体与菌株 |
| 4.1.3 酶与引物 |
| 4.1.4 主要试剂与仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 重组载体的构建 |
| 4.2.2 发根农杆菌A.rhizogenes K599 诱导构建大豆发状根系统 |
| 4.2.3 大豆发状根系统诱导率验证 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 各重组载体验证结果 |
| 4.3.2 发状根系统的获得及诱导阳性率分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 干旱胁迫下大豆发状根系统GmHdz4的功能分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 主要试剂与仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 聚乙二醇模拟多时间段干旱胁迫 |
| 5.2.2 干旱胁迫下光合气体交换参数检测 |
| 5.2.3 干旱胁迫下发状根根系结构及根冠比检测 |
| 5.2.4 干旱胁迫下发状根渗透调节物质含量检测 |
| 5.2.5 干旱胁迫下发状根根系损伤情况检测 |
| 5.2.6 干旱胁迫下发状根活性氧(ROS)含量及抗氧化酶活性检测 |
| 5.2.7 数据处理及统计分析 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 干旱胁迫下GmHdz4对大豆光合气体交换的影响 |
| 5.3.2 干旱胁迫下GmHdz4对大豆根系形态建成的影响 |
| 5.3.3 干旱胁迫下GmHdz4对根系渗透调节物质的影响 |
| 5.3.4 干旱胁迫下GmHdz4对根系损伤指标的影响 |
| 5.3.5 干旱胁迫下GmHdz4对根系抗氧化酶系统的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
（5）shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFAP1L1 在 NSCLC 中的表达及临床意义 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AFAP1L1在NSCLC组和正常肺组织组中的表达 |
| 1.2.2 AFAP1L1 表达与 NSCLC 患者临床病理特征及病理分期的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、shRNA 沉默 AFAP1L1 对肺癌细胞功能影响的体外研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 AFAP1L1基因在肺癌细胞系中的表达 |
| 2.2.2 shRNA靶点设计和AFAP1L1 基因慢病毒载体构建 |
| 2.2.3 RT-PCT检测AFAP1L1 m RNA表达 |
| 2.2.4 Western Blot检测AFAP1L1 的蛋白表达 |
| 2.2.5 shRNA沉默AFAP1L1 导致A549 细胞增殖降低 |
| 2.2.6 shRNA沉默AFAP1L1 抑制A549 细胞周期进程 |
| 2.2.7 shRNA沉默AFAP1L1 促进A549 细胞凋亡 |
| 2.2.8 shRNA沉默AFAP1L1对A549 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.2.9 Path Scan细胞内信号转导阵列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 AFAP1L1的结构与功能 |
| 2.3.2 RNA干扰及对AFAP1L1 基因的沉默作用 |
| 2.3.3 慢病毒载体介导的 RNA 干扰 AFAP1L1 表达对肺癌细胞 A549 生物学功能的影响 |
| 2.3.4 AFAP1L1抑制肿瘤生长的作用机制探讨 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFAP1L1抑制肺腺癌细胞生长的体内试验研究 |
| 3.1 对象及方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 慢病毒转染A549细胞 |
| 3.2.2 MTT 检验细胞增殖能力 |
| 3.2.3 移植瘤的生长情况及活体成像情况 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.3.2 慢病毒载体及其介导的RNA干扰应用 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 APAP家族:结构、功能及在肿瘤中的作用 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 ESCRT系统的组成 |
| 1.1.1 ESCRT-0 复合体 |
| 1.1.2 ESCRT-Ⅰ复合体 |
| 1.1.3 ESCRT-Ⅱ复合物 |
| 1.1.4 ESCRT-Ⅲ复合体 |
| 1.1.5 Vps4 |
| 1.1.6 Alix |
| 1.2 晚期结构域L-domain |
| 1.3 杆状病毒简介 |
| 1.3.1 杆状病毒的分类 |
| 1.3.2 杆状病毒的形态结构 |
| 1.3.3 杆状病毒生活周期 |
| 1.3.4 杆状病毒核心基因 |
| 1.3.5 苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒简介 |
| 1.4 多个影响BV产量的杆状病毒核心基因简介 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 主要实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞、菌株与质粒 |
| 2.2.2 细菌培养基 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 常用缓冲液 |
| 2.2.5 常用抗生素溶液的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌化学感受态细胞制备 |
| 2.3.2 DH10Bac电转感受态细胞制备 |
| 2.3.3 草地贪夜蛾Sf9 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.4 ESCRT-Ⅲ组分基因的克隆及瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.5 AcMNPV核心基因ac93 突变体的构建 |
| 2.3.6 ac93 及其系列突变瞬时表达质粒的构建 |
| 2.3.7 构建表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ各个组分的重组AcMNPV bacmid |
| 2.3.8 细胞活性测定 |
| 2.3.9 病毒缺失-补偿实验 |
| 2.3.10 病毒滴度测定 |
| 2.3.11 ac93 重组病毒的滴度测定 |
| 2.3.12 AcMNPV基因表达与基因组DNA复制检测 |
| 2.3.13 AcMNPV的入侵分析 |
| 2.3.14 AcMNPV出芽释放分析 |
| 2.3.15 免疫共沉淀分析(Co-immunoprecipitation) |
| 2.3.16 Western blotting |
| 2.3.17 双分子荧光互补分析 |
| 2.3.18 激光共聚焦显微镜分析 |
| 2.3.19 透射电子显微镜观察 |
| 2.3.20 同源重组线性片段ac93US-Cm-ac93DS的制备 |
| 2.3.21 同源重组感受态细胞DH10BAC的制备 |
| 2.3.22 电击转化同源重组 |
| 2.3.23 Bacmid DNA提取 |
| 2.3.24 重组病毒v AcIE1-GFP-PP-GFP-PP-Polh的构建 |
| 2.3.25 ac93 补回型重组病毒vAc ac93~(REP-PP-GFP-PP-Polh)的构建 |
| 2.3.26 重组病毒的PCR鉴定 |
| 2.3.27 helper质粒的去除 |
| 2.3.28 多步病毒生长曲线测定 |
| 第三章 ESCRT-Ⅲ在 AcMNPV侵染中的作用 |
| 3.1 ESCRT-Ⅲ核心基因的克隆 |
| 3.2 ESCRT-Ⅲ核心基因的氨基酸序列比对分析 |
| 3.3 ESCRT-Ⅲ核心蛋白的表达 |
| 3.4 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对感染性AcMNPV BV的影响 |
| 3.5 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对AcMNPV侵染早期阶段的影响 |
| 3.6 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分对AcMNPV BV入侵的影响 |
| 3.7 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分显性-负性突变体对BV出芽释放的影响 |
| 3.8 过表达GFP标签的ESCRT-Ⅲ组分显性-负性突变体对AcMNPV的子代病毒核衣壳从核膜释放的影响 |
| 3.9 小结 |
| 3.10 讨论 |
| 第四章 Ac93与ESCRT-Ⅲ亚基的相互作用 |
| 4.1 Ac93和ESCRT-Ⅲ亚基的相互作用 |
| 4.2 Ac93和Vps4 的相互作用 |
| 4.3 Ac93 与病毒核心蛋白Ac76、Ac103 的相互作用 |
| 4.4 小结 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 Ac93 突变体与ESCRT-Ⅲ/Vps4 的相互作用 |
| 5.1 Ac93 及其同源蛋白的氨基酸序列比对 |
| 5.2 Ac93 的结构域分析 |
| 5.2.1 晚期结构域 |
| 5.2.2 亮氨酸拉链 |
| 5.2.3 核受体模序 |
| 5.2.4 MIM1 模序 |
| 5.2.5 CRAC-motif |
| 5.3 Ac93 突变体的构建 |
| 5.3.1 克隆策略 |
| 5.3.2 点突变系列瞬时表达载体的构建 |
| 5.3.3 ac93 系列点突变BIFC瞬时表达载体的鉴定 |
| 5.3.4 MIM1 模序保守的存在于几乎所有的Ac93 同源物中 |
| 5.3.5 Ac93 突变体自身相互作用 |
| 5.3.6 Ac93 突变体与Vps4 的相互作用 |
| 5.3.7 Ac93 突变体与Vps4 MIT结构域的相互作用 |
| 5.3.8 Ac93 突变体与ESCRT-Ⅲ蛋白的相互作用 |
| 5.3.9 Ac93 突变体与病毒核心蛋白Ac76和Ac103 的相互作用 |
| 5.3.10 Ac93 其突变体与ESCRT-Ⅲ组份蛋白、病毒核心蛋白的的表达 |
| 5.4 小结 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 Ac93 突变体对Ac MNPV复制的影响 |
| 6.1 ET同源重组技术和Bac-to-Bac系统 |
| 6.2 构建ac93 缺失型重组bacmid流程 |
| 6.2.1 ac93 上游侧翼序列和下游侧翼序列的鉴定 |
| 6.2.2 重组质粒pIE-ac93US-Cm-ac93DS的鉴定 |
| 6.2.3 重组Bacmid vAc~(ac93ko)的鉴定 |
| 6.2.4 转座载体IE1-GFP-PFB、ac93p-ac93-pFB的鉴定 |
| 6.2.5 ac93 补回型重组病毒vAc~(ac93REP-PP-GFP-PP-Polh)的鉴定 |
| 6.2.6 点突变系列重组载体93p-?ac93-HApBlue的构建 |
| 6.2.7 点突变系列转座载体93p-?ac93-HA-pFB的构建与鉴定 |
| 6.2.8 补回型重组病毒vAc~(△~(ac93REP-PP-GFP-PP-Polh))的构建与鉴定 |
| 6.3 ac93 点突变重组病毒对感染性病毒粒子产量的影响 |
| 6.4 Ac93的MIM1 模序对核衣壳从核膜释放以及核内微泡的形成的影响 |
| 6.5 小结 |
| 6.6 讨论 |
| 第七章 粉纹夜蛾和草地贪夜蛾的线粒体基因组分析 |
| 7.1 粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)线粒体基因组分析 |
| 7.2 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的线粒体基因组分析 |
| 7.3 小结 |
| 第八章 结论与讨论 |
| 8.1 ESCRT-Ⅲ是 AcMNPV粒子有效入侵和释放所必需的 |
| 8.2 MIM1模序参于Ac93蛋白与Ac93蛋白、ESCRT-Ⅲ/Vps4蛋白和其他病毒蛋白的互作 |
| 8.3 MIM1 模序在Ac MNPV侵染中发挥重要的作用 |
| 8.4 Ac93蛋白与Ac93蛋白、ESCRT-Ⅲ/Vps4蛋白和其他病毒蛋白的互作主要发生在核膜 |
| 8.7 粉纹夜蛾和草地贪夜蛾线粒体基因组分析 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）斑马鱼foxp3a和foxp3b的cDNA克隆及其在细菌免疫应答中的表达研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 1 硬骨鱼类免疫系统研究进展 |
| 1.1 免疫器官 |
| 1.2 调节性T细胞 |
| 2 FOXP3 研究现状及其在免疫应答中的作用 |
| 2.1 FOXP3 研究现状 |
| 2.2 鱼类免疫应答研究进展 |
| 3 科学问题的提出和本研究的目的意义 |
| 实验设计路线 |
| 第二章 斑马鱼foxp3a、foxp3b cDNA克隆和生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 成鱼不同组织取材 |
| 1.5 总RNA提取及反转录合成第一链 |
| 1.6 引物设计 |
| 1.7 3’-与5’-RACE-ready cDNA文库构建 |
| 1.8 斑马鱼foxp3a和 foxp3b基因3’端RACE和5’端RACE |
| 1.9 生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 斑马鱼foxp3 全长cDNA获得及序列分析 |
| 2.2 斑马鱼foxp3a和 foxp3b基因结构图 |
| 2.3 几种脊椎动物FOXP3 氨基酸序列比对 |
| 2.4 FOXP系统进化树 |
| 2.5 斑马鱼FOXP3A和 FOXP3B线性分析图 |
| 3 讨论 |
| 第三章 斑马鱼foxp3a和 foxp3b基因时空表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 foxp3a和 foxp3b基因的3’cDNA扩增 |
| 1.6 地高辛标记的探针制备 |
| 1.7 整体胚原位杂交(Whole In Situ Hybridization) |
| 2 实验结果 |
| 2.1 斑马鱼foxp3a和 foxp3b胚胎发育中不同时间点的差异表达情况 |
| 2.2 斑马鱼foxp3a和 foxp3b不同组织的差异表达情况 |
| 2.3 foxp3a基因和foxp3b基因的3’cDNA扩增及线性化 |
| 2.4 foxp3a基因和foxp3b基因的反义探针和正义探针制备 |
| 2.5 斑马鱼foxp3a和 foxp3b基因整体胚胎原位杂交 |
| 3 讨论 |
| 第四章 嗜水气单胞菌感染斑马鱼后肾脏的免疫应答情况 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 嗜水气单胞菌感染模型构建 |
| 1.5 总RNA提取及反转录 |
| 1.6 引物设计 |
| 1.7 实时荧光定量PCR |
| 1.8 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 嗜水气单胞菌感染斑马鱼肾脏中il-1β、foxp3a和 foxp3b的表达变化 |
| 3 讨论 |
| 第五章 斑马鱼FOXP3A和 FOXP3B分子的原核表达及多克隆抗血清制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 foxp3a和 foxp3b基因表达序列扩增 |
| 1.4 foxp3a表达序列优化 |
| 1.5 foxp3a和 foxp3b原核表达载体的构建 |
| 1.6 诱导pET-32a-foxp3a和 pET-32a-s-foxp3b的原核表达 |
| 1.7 包涵体中融合蛋白的纯化、多克隆抗体的制备 |
| 1.8 上清中融合蛋白的纯化、多克隆抗体的制备 |
| 1.9 多克隆抗血清效价测定 |
| 1.10 Western blot检测抗体特异性 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 foxp3a基因优化及原核表达载体的构建 |
| 2.2 foxp3b基因扩增及原核表达载体的构建 |
| 2.3 融合蛋白的表达与纯化 |
| 2.4 融合蛋白多克隆抗体的制备及效价检测 |
| 2.5 Western blot检测抗体特异性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（8）大豆子叶折叠突变体的基因初步定位、多组学数据分析以及相关基因的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大豆图位克隆的研究进展 |
| 1.1 图位克隆的研究原理 |
| 1.2 图位克隆的研究对象 |
| 1.3 DNA分子标记技术的发展 |
| 1.4 图位克隆的研究步骤 |
| 1.5 大豆突变体基因定位的研究进展 |
| 1.6 大豆数量性状QTL定位的研究进展 |
| 2 高通量测序技术 |
| 2.1 生物信息学的发展 |
| 2.2 高通量测序技术的发展 |
| 2.3 高通量测序技术在植物分子生物学方面的应用 |
| 2.4 全基因组重测序技术路线 |
| 2.5 全基因组甲基化测序技术路线 |
| 3 植物HD-Zip转录因子的研究进展 |
| 4 植物LBD转录因子的研究进展 |
| 5 本研究的目的意义及内容 |
| 第二章 大豆子叶折叠突变体的表型鉴定及基因初步定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂及仪器 |
| 1.3 cco突变体及杂交后代表型鉴定 |
| 1.4 子叶贮藏细胞观察 |
| 1.5 种子蛋白质和油分含量测定 |
| 1.6 水解氨基酸测定 |
| 1.7 花粉活力测定 |
| 1.8 cco突变体基因定位实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大豆子叶折叠突变体cco的表型鉴定 |
| 2.2 大豆子叶折叠突变体cco的基因初步定位 |
| 3 讨论 |
| 第三章 全基因组DNA测序分析大豆子叶折叠突变体 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 WT和cco全基因组重测序数据统计 |
| 2.2 WT和cco分别与Williams82的基因组变异分析 |
| 2.3 WT和cco间的基因组变异分析 |
| 2.4 基于全基因组变异分析控制大豆子叶折叠可能的候选基因 |
| 3 讨论 |
| 第四章 全基因组DNA甲基化分析大豆子叶折叠突变体 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 全基因组DNA甲基化测序数据统计 |
| 2.2 WT和cco全基因组甲基化分析 |
| 2.3 WT和cco间差异甲基化区域分析 |
| 2.4 WT和cco间差异甲基化基因分析 |
| 2.5 基于全基因组甲基化测序鉴定与大豆子叶折叠突变体发育相关的基因 |
| 3 讨论 |
| 第五章 Gmhdz20基因的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 实验菌株及载体 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 1.4 生物信息学分析 |
| 1.5 植物核酸提取及cDNA第一链的合成 |
| 1.6 基因表达分析 |
| 1.7 载体构建 |
| 1.8 亚细胞定位 |
| 1.9 农杆菌介导的大豆子叶节转化 |
| 1.10 农杆菌介导的大豆毛状根转化 |
| 1.11 GUS染色 |
| 1.12 酵母转化及筛库 |
| 1.13 沾花法(floral dipping)转化拟南芥 |
| 1.14 拟南芥叶片石蜡切片制作 |
| 1.15 拟南芥叶片表皮细胞FM4-64染色 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 大豆子叶折叠突变体发育相关的基因筛选 |
| 2.2 Gmhdz20基因的克隆及序列分析 |
| 2.3 Gmhdz20的组织表达分析 |
| 2.4 Gmhdz20的亚细胞定位分析 |
| 2.5 Gmhdz20的调控因子分析 |
| 2.6 Gmhdz20互作蛋白的筛选 |
| 2.7 Gmhdz20转化拟南芥功能验证 |
| 3 讨论 |
| 第六章 大豆LBD基因的家族鉴定与表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 大豆LBD基因的鉴定及数据处理 |
| 1.2 植物材料 |
| 1.3 非生物胁迫及激素处理 |
| 1.4 试剂与仪器 |
| 1.5 植物核酸提取及cDNA第一链的合成 |
| 1.6 荧光定量qRT-PCR表达分析 |
| 1.7 大豆LBD基因的测序验证 |
| 1.8 其它植物LBD基因的信息 |
| 1.9 大豆LBD蛋白中的motif序列 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 全基因组鉴定大豆LBD基因家族 |
| 2.2 大豆LBD基因的染色体定位及复制模式分析 |
| 2.3 大豆LBD蛋白的结构域分析 |
| 2.4 大豆LBD基因进化、基因结构及蛋白motif分析 |
| 2.5 大豆LBD基因的组织表达分析 |
| 2.6 大豆LBD基因对胁迫及激素处理的响应分析 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 本研究创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表及待发表论文 |
| 致谢 |
（9）玉米花丝特异性表达基因ZmbZIP25的转录调控和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物bZIP转录因子 |
| 1.1.1 bZIP转录因子的结构 |
| 1.1.2 植物bZIP转录因子的分类及生物学功能 |
| 1.1.3 玉米中的bZIP转录因子 |
| 1.2 植物抗病 |
| 1.2.1 植物抗病的反应途径 |
| 1.2.2 植物抗病策略 |
| 1.3 玉米花丝 |
| 1.3.1 玉米花丝的形态结构 |
| 1.3.2 玉米花丝的功能 |
| 1.3.3 玉米花丝与病害 |
| 1.4 玉米花丝中基因的转录调控 |
| 1.4.1 启动子的结构与转录调控 |
| 1.4.2 柱头特异性表达的基因和启动子 |
| 1.4.3 玉米花丝特异性启动子 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 宿主菌 |
| 2.1.2 质粒载体 |
| 2.1.3 植物材料 |
| 2.1.4 试剂及耗材 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 引物及探针 |
| 2.2 常用培养基及溶液的配制 |
| 2.2.1 常用培养基的配制 |
| 2.2.2 常用溶液的配制 |
| 2.3 实验所用试剂的配制 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.2 碱裂解法小提质粒DNA |
| 2.3.3 CTAB法小提植物基因组DNA |
| 2.3.4 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 |
| 2.3.5 农杆菌介导的玉米幼胚转化 |
| 2.3.6 基因枪法介导的玉米遗传转化 |
| 2.3.7 His融合蛋白的原核诱导表达 |
| 2.3.8 SDS-PAGE及Western杂交 |
| 2.3.9 PEG/LiAc法转化酵母 |
| 2.3.10 酵母单杂交试验 |
| 2.3.11 玉米原生质体的制备与转化 |
| 2.3.12 原位杂交 |
| 2.3.13 GUS组织化学染色 |
| 2.3.14 茚三酮法测定赖氨酸含量 |
| 2.3.15 透射电镜的观察 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.4.2 碱裂解法提取质粒DNA |
| 2.4.3 高纯度质粒DNA的提取 |
| 2.4.4 农杆菌感受态细胞的制备及电击转化 |
| 2.4.5 CTAB法小提植物基因组DNA |
| 2.4.6 PCR扩增目的基因 |
| 2.4.7 TRIzol法提取植物总RNA |
| 2.4.8 cDNA第一链的合成、RT-PCR及定量PCR |
| 2.4.9 5'RACE实验 |
| 2.4.10 蘸花法转化拟南芥 |
| 2.4.11 酵母转录激活实验 |
| 2.4.12 酵母单杂交 |
| 2.4.13 SDS-PAGE和Western blot |
| 2.4.14 玉米原生质体的制备及转化 |
| 2.4.15 基因枪法介导的玉米遗传转化 |
| 2.4.16 农杆菌介导的玉米幼胚转化 |
| 2.4.17 植物材料的固定包埋及石蜡切片的制备和染色 |
| 2.4.18 原位杂交 |
| 2.4.19 玉米籽粒中赖氨酸的测定 |
| 2.4.20 玉米籽粒中蛋白含量的测定 |
| 2.4.21 玉米未成熟种子胚乳透射电镜的观察 |
| 2.4.22 玉米成熟种子扫描电镜的观察 |
| 第三章 玉米ZmbZIP25基因的转录调控与功能分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 ZmbZIP25的表达模式分析 |
| 3.2.1 转录组数据及RT-PCR分析ZmbZIP25的表达模式 |
| 3.2.2 逆境胁迫及激素处理下ZmbZIP25的表达模式分析 |
| 3.2.3 ZmbZIP25在花丝中的表达部位 |
| 3.3 ZmbZIP25基因转录起始位点的确定 |
| 3.4 ZmbZIP25启动子的克隆及分析 |
| 3.5 ZmbZIP25启动子在拟南芥中的活性分析 |
| 3.5.1 pZmbZIP25-2600::GUS和pZmbZIP25-2450::GUS载体的构建 |
| 3.5.2 转化拟南芥阳性植株的获得 |
| 3.5.3 ZmbZIP25启动子特异性驱动报告基因GUS的表达 |
| 3.5.4 ZmbZIP25第二个内含子的剪切 |
| 3.6 ZmbZIP25启动子在玉米花丝中的活性分析 |
| 3.6.1 载体的构建和玉米转化 |
| 3.6.2 ZmbZIP25启动子驱动报告基因GFP/GUS在玉米花丝中特异表达 |
| 3.7 ZmbZIP25启动子的-1117-957区段负责花丝特异性 |
| 3.8 玉米ZmbZIP25的克隆及转录因子的特性分析 |
| 3.8.1 ZmbZIP25基因编码序列的克隆 |
| 3.8.2 ZmbZIP25的亚细胞定位分析 |
| 3.8.3 ZmbZIP25在酵母中的转录激活活性分析 |
| 3.8.4 ZmbZIP25对元件的结合能力分析 |
| 3.9 ZmbZIP25的功能研究 |
| 3.9.1 在拟南芥中异源表达ZmbZIP25 |
| 3.9.2 ZmbZIP25在玉米中的功能分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 ZmbZIP25在玉米花丝的木质部中特异性表达 |
| 4.2 ZmbZIP25启动子的元件分析 |
| 4.3 ZmbZIP25两个内含子的剪切 |
| 4.4 ZmbZIP25可能通过与其它蛋白形成异源二聚体来参与抗病 |
| 4.5 ZmbZIP25在拟南芥和玉米中功能的初步分析 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 Zm675基因在玉米品质改良中的应用 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.2 研究结果 |
| 1.2.1 Zm675基因的克隆及序列分析 |
| 1.2.2 转基因Zm675玉米材料的获得 |
| 1.2.3 转基因玉米后代分析 |
| 1.2.4 Zm675在转基因玉米中作用机制的初步探究 |
| 1.2.5 转Zm675玉米农艺性状的初步分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 Zm675可以提高玉米种子的赖氨酸含量 |
| 1.3.2 Zm675可以提高玉米种子的蛋白含量 |
| 1.3.3 Zm675的玉米品质性状和农艺性状的评估 |
| 1.4 结论 |
| 1.5 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于mNeonGreen和mNeptune的双分子荧光互补系统的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质相互作用 |
| 1.2 双分子荧光互补技术 |
| 1.2.1 BiFC技术原理 |
| 1.2.2 BiFC技术的起源 |
| 1.2.3 BiFC技术的建立 |
| 1.2.4 BiFC技术的发展 |
| 1.2.5 BiFC技术的应用 |
| 1.2.6 BiFC技术的优势与缺陷 |
| 1.3 mNeonGreen |
| 1.4 mNeptune |
| 1.5 碱性亮氨酸拉链 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料和仪器设备 |
| 2.1.1 细胞和菌株 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 常用仪器 |
| 2.1.5 培养基和抗生素 |
| 2.1.6 主要溶液 |
| 2.1.7 酶与生化试剂 |
| 2.2 实验方法及步骤 |
| 2.2.1 质粒的构建 |
| 2.2.2 HEK 293T细胞的培养与传代 |
| 2.2.3 HEK 293T细胞的瞬时转染 |
| 2.2.4 细胞观察与成像 |
| 2.2.5 流式细胞术分析 |
| 2.2.6 蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.7 蛋白浓度测定 |
| 2.2.8 SDS-PAGE |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 mNeonGreen BiFC系统 |
| 3.1.1 mNeonGreen BiFC系统质粒的构建 |
| 3.1.2 mNeonGreen BiFC系统质粒的验证 |
| 3.1.3 mNeonGreen BiFC系统在活细胞中的验证 |
| 3.2 mNeptune BiFC系统 |
| 3.2.1 mNeptune BiFC系统质粒的构建 |
| 3.2.2 mNeptune BiFC系统质粒的验证 |
| 3.2.3 mNeptune BiFC系统细胞实验结果 |
| 3.2.4 mNeptune BiFC系统体外实验结果 |
| 3.3 不同亮氨酸拉链接法的BiFC系统 |
| 3.3.1 不同亮氨酸拉链接法的BiFC系统载体的构建 |
| 3.3.2 不同亮氨酸拉链接法的BiFC系统载体的验证 |
| 3.3.3 不同亮氨酸拉链接法的BiFC系统细胞实验结果 |
| 第4章 讨论与展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、亮氨酸拉链结构蛋白基因表达载体选择（论文参考文献）
- [1]草莓bZIP11和FaSigma转录因子克隆、表达和功能研究初探[D]. 吴文山. 安徽农业大学, 2020
- [2]紫花苜蓿MsHB7基因的克隆及功能分析[D]. 候怡谣. 哈尔滨师范大学, 2020(01)
- [3]转录因子NbbZIP60在马铃薯Y病毒侵染中的调控作用[D]. 何青云. 中国农业科学院, 2020
- [4]HD-Zip转录因子GmHdz4对大豆耐旱性影响的研究[D]. 钟宣伯. 浙江大学, 2020(01)
- [5]shRNA沉默AFAP1L1基因对肺腺癌细胞增殖影响的体内外研究[D]. 王猛. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]宿主细胞ESCRT-Ⅲ复合体在杆状病毒AcMNPV出芽型病毒粒子侵染中的作用[D]. 刘婷婷. 西北农林科技大学, 2019
- [7]斑马鱼foxp3a和foxp3b的cDNA克隆及其在细菌免疫应答中的表达研究[D]. 陈芳. 山西大学, 2019(01)
- [8]大豆子叶折叠突变体的基因初步定位、多组学数据分析以及相关基因的功能研究[D]. 杨慧. 南京农业大学, 2018(05)
- [9]玉米花丝特异性表达基因ZmbZIP25的转录调控和功能研究[D]. 李婉影. 中国农业大学, 2018(02)
- [10]基于mNeonGreen和mNeptune的双分子荧光互补系统的研究[D]. 严闯. 湖北大学, 2018(02)