Aspergillus pachycristatus棘白菌素B合成中脯氨酸羟化酶的功能分析及CRISPR/Cas9基因编辑体系的构建

论文摘要

丝状真菌可以产生结构多样的次级代谢产物,是天然药物的重要来源。但由于很多次级代谢产物的合成途径及机制并不清楚,且某些具有特定生物活性的次代产物产量低而难以实现高水平工业化生产,因此如何提高丝状真菌次级代谢产物的产量和活性成为当前研究的热点。棘白菌素类药物是目前用于治疗由念珠菌等真菌引起的入侵性感染最有效的药物,由某些特定的丝状真菌合成。目前已经上市的棘白菌素类药物包括卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净。棘白菌素类药物价格昂贵,使其在临床上的广泛应用受到很大的限制。因此深入研究棘白菌素类抗生素的生物合成机制,从而提高棘白菌素类的产量和活性,降低其使用成本,对有效控制相关真菌感染性疾病尤为重要。棘白菌素B是由丝状真菌Aspergilluspachycristatus产生的环状酯肽类次级代谢产物,是合成阿尼芬净的前体物质。负责合成棘白菌素B的非核糖体多肽合成酶（NRPS）基因簇中还包括可催化其多个组成氨基酸发生羟基化修饰的羟化酶,其中参与棘白菌素B环状六肽中脯氨酸和4-甲基脯氨酸羟基化的羟化酶尚未被鉴定和表征。本论文对棘白菌素B合成途径中的一个关键脯氨酸羟化酶（HtyE）进行探究。通过体内与体外相结合的方法对其酶学性质、功能及关键位点进行鉴定。同时由于A.pachycristatus 菌株的遗传操作相对困难,本论文在该菌株中建立了CRISPR/Cas9系统,并探索利用该系统对菌株进行基因组编辑。取得的主要结果如下:一、对棘白菌素类抗生素产生菌株A.Pachycristatus和A.aculeatus基因组测序,明确棘白菌素类抗生素合成基因簇的结构组成。A pachycristatus和A aculeatus可以产生两种不同的棘白菌素类抗生素,分别为棘白菌素B和aculeacin A。对菌株A.pachycristatus 和A aculeatus基因组测序,明确棘白菌素类抗生素的合成由两个连续的子基因簇ecd和hty负责。通过HPLC检测得知棘白菌素B的产量随着A pachycristatus的生长而不断积累。生长到第五天时,产量达到最大值,约为0.7 mg/g。A.pachycristatus 棘白菌素B合成基因簇各基因转录分析表明ecdA和ecdK的转录量较低,可能是棘白菌素B合成过程中的限制性因素。二、Ap-htyE在A.pachycristatus 合成棘白菌素B过程中具有重要功能。HtyE以脯氨酸为底物时可同时生成反式-4-羟基脯氨酸和反式-3-羟基脯氨酸,但不同来源的HtyE催化生成两种羟基脯氨酸的比例不同。利用同源重组原理在A.pachycristatus 菌株中敲除Ap-htyE基因,通过对敲除菌株发酵产物进行HPLC、LC-MS和抗白色念珠菌活性检测,结果显示Ap-htyE的敲除导致缺失菌株不能产生棘白菌素B,且发酵产物不具有抗白色念珠菌活性,说明Ap-hthE对棘白菌素B的合成及活性至关重要。通过氨基酸序列比对在A.pachycristatus 和A.aculeatus中找到可能的脯氨酸羟化酶HtyE,将其分别命名为Ap-HtyE和Aa-HtyE,氨基酸序列相似度为69.6%。通过异源表达纯化Ap-HtyE和Aa-HtyE,研究它们体外功能及酶学性质。发现在以脯氨酸为底物时,Ap-HtyE和Aa-HtyE均可以生成两种不同形式的羟基化氨基酸,分别为反式-4-羟基脯氨酸和反式-3-羟基脯氨酸。这两种氨基酸分别是棘白菌素B环状六肽第3和第6位的组成成分。Ap-HtyE也可以甲基脯氨酸为底物,但仅催化其生成3-羟基-甲基脯氨酸。值得注意的是,Ap-HtyE和Aa-HtyE生成两种不同形式的羟基脯氨酸的比例有很大的不同,分别为2.5:1和7.2:1。三、Ap-HtyE Leu182是决定Ap-HtyE对脯氨酸区域选择性的关键氨基酸位点,Ap-HtyE对甲基脯氨酸C3位的羟基化效率不受脯氨酸修饰产物比例变化的影响。通过同源模建构建了 Ap-HtyE的结构模型,依此对活性中心氨基酸位点进行丙氨酸扫描、位点饱和突变以及组合突变。结果表明,Leu182是决定脯氨酸羟基化位置选择性的重要位点。将Leu182突变为天冬酰胺后,在以脯氨酸为底物时生成的反式-4-羟基脯氨酸和反式-3-羟基脯氨酸的比例由2.5:1变为7.4:1。突变结果进一步显示,Ap-HtyE对于甲基脯氨酸C3位的羟基化不受其催化脯氨酸修饰产物比例变化的影响。四、在A.pachycristatus菌株中引入CRISPR/Cas9系统,并利用该系统成功进行了pyrG和pksP的敲除。由于A.pachycristatus 菌株的同源重组效率较低,导致在A.pachycristaftus菌株的遗传操作比较困难,从而影响对棘白菌素B合成途径机制的深入探究。CRISPR/Cas9系统是提高基因组编辑效率的有效工具。本论文利用i.pachycristatus自身的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（PgpdA）启动子和终止子（TgpdA）驱动Cas9的表达,利用来源于黑曲霉的5s rRNA启动子驱动引导RNA的表达。进一步将此双元件表达载体导入i.pachycristatus 中以对尿苷合成途径关键基因pyrG进行失活。结果表明,CRISPR/Cas9系统可用于A pachycristatus基因组编辑中。在同时共转donor DNA时,对分生孢子色素聚酮合酶基因pksP进行失活,结果表明,当donor DNA的长度仅为40bp时,敲除效率为93.75%。从而显示CRlISPR/Cas9系统在A.pachycristatus 基因编辑中的有效性和可行性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一章 绪论
•   1.1 真菌次级代谢产物及其应用
•     1.1.1 聚酮合酶（Polyketide synthase,PKS）
•     1.1.2 非核糖体多肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS）
•   1.2 抗真菌药物的研究进展
•     1.2.1 传统的抗真菌药物
•     1.2.2 棘白菌素类药物
•   1.3 棘白菌素B的研究进展
•     1.3.1 棘白菌素B的合成基因簇
•     1.3.2 棘白菌素B的合成过程
• 2+依赖的氧化酶研究进展'>    1.3.3 α-酮戊二酸/Fe²⁺依赖的氧化酶研究进展
•   1.4 CRISPR/Cas9系统的研究进展及应用
•     1.4.1 CRISPR/Cas9系统
•     1.4.2 CRISPR/Cas9系统的应用
•   1.5 立题依据及研究内容
• 第二章 Aspergillus pachycristatus合成棘白菌素B的生理遗传表征
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株
•     2.1.2 培养基及培养条件
•     2.1.3 引物及序列
•     2.1.4 试剂与仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 A.pachycristatus的液体生长测定
•     2.2.2 A.pachycristatus的发酵培养及发酵产物萃取
•     2.2.3 棘白菌素B的高效液相色谱检测
•     2.2.4 Trizol法提取真菌中总RNA
•     2.2.5 反转录
•     2.2.6 实时荧光定量PCR分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 A.pachycristatus菌株生长与棘白菌素B产量的关系
•     2.3.2 A.pachycristatus ATCC 58397和A.aculeatus CPCC 400035的基因组测序与比较分析
•     2.3.3 棘白菌素B合成基因簇结构与转录分析
•     2.3.4 常用启动子转录分析
•     2.3.5 组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对棘白菌素B产量的影响
•   2.4 本章小结
• 第三章 棘白菌素B合成途径中脯氨酸羟化酶HtyE的功能分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株与质粒
•     3.1.2 培养基及培养条件
•     3.1.3 所用引物及序列
•     3.1.4 主要试剂与仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 大肠杆菌感受态制备
•     3.2.2 Ap-htyE和Aa-htyE异源表达质粒构建
•     3.2.3 菌种保藏
•     3.2.4 Ap-HtyE和Aa-HtyE的表达
•     3.2.5 Ap-HtyE和Aa-HtyE的纯化
•     3.2.6 SDS-PAGE
•     3.2.7 Ap-HtyE和Aa-HtyE酶活力测定
•     3.2.8 氨基酸的衍生及HPLC检测
•     3.2.9 在A.pachycristatus中敲除Ap-htyE
•     3.2.10 真菌基因组的提取
•     3.2.11 棘白菌素B对白色念珠菌的抗真菌活性检测
•   3.3 实验结果与讨论
•     3.3.1 棘白菌素类抗生素合成途径中脯氨酸羟化酶HtyE的鉴定
•     3.3.2 hyE在A.pachycristatus合成棘白菌素B过程中的功能分析
•     3.3.3 HtyE的生化性质探究
•   3.4 本章小结
• 第四章 脯氨酸羟化酶参与修饰位点选择的关键氨基酸的鉴定
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株与质粒
•     4.1.2 培养基及培养条件
•     4.1.3 所用引物及序列
•     4.1.4 主要试剂及仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 Ap-HtyE突变体构建
•     4.2.2 Ap-HtyE同源模建
•   4.3 实验结果与讨论
•     4.3.1 Ap-HtyE的同源模建
•     4.3.2 Ap-HtyE突变体性质探究
•   4.4 本章小结
• 第五章 CRISPR/Cas9基因编辑系统在A.pachycristatus中的构建
•   5.1 实验材料
•     5.1.1 菌株与质粒
•     5.1.2 培养基及培养条件
•     5.1.3 所用引物及序列
•     5.1.4 主要试剂与仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 双链引导RNA获得方法
•     5.2.2 酶切连接方法
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 Cas9在A. pachycristatus中的表达与定位
•     5.3.2 利用CRISPR/Cas9在A. pachycristatus中敲除pyrG
•     5.3.3 利用CRISPR/Cas9在A. pachycristatus中敲除pksP
•   5.4 本章小结
• 全文总结与展望
• 不足之处与展望
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张峰

导师: 刘巍峰,孟祥锋

关键词: 棘白菌素,脯氨酸羟化酶

来源: 山东大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,药学

单位: 山东大学

分类号: Q78;R915

总页数: 112

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