伪狂犬病病毒潜伏感染相关转录物LLT表达特征的研究

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起多种家畜和野生动物的急性、热性传染病,但只有猪是PRV的唯一贮存宿主。伪狂犬病能给养猪业造成极大的经济损失,特别是2011年末以来PRV变异株在我国的爆发流行,严重影响了养猪业的健康发展。与其他疱疹病毒类似,PRV急性感染后能够在宿主体内形成潜伏感染,潜伏感染时期,病毒基因组不复制,也不表达病毒蛋白,仅大量转录病毒潜伏相关转录物（Latency Associated Transcripts,LATs）。然而,长期以来,关于LAT转录特征及调控机制的研究较为缺乏,其转录与调控机制及对病毒感染复制的影响也不清楚。LATs是由大的潜伏相关转录本（Large Latency Transcripts,LLT）分子剪接加工形成的,为了研究PRV LLT两个启动子LAP1和LAP2在其转录调控方面的作用机制,本研究首先构建一系列供体质粒,包括缺失LAP1、缺失LAP1并添加绝缘子cHS4或添加强启动子CMV、同时缺失LAP1/P2等。然后,利用BAC/galK系统将galK基因替换LLT的启动子区域,经正、负筛选后将构建不同质粒的目的基因替换galK基因,经PCR鉴定筛选到不同的阳性克隆,分别提取各个阳性克隆的BAC DNA,并将其与pcDNA3.1-cre质粒共转染至Vero细胞,成功拯救出缺失相关启动子的突变病毒（vJS-△LAP1、vJS-cHS4-△LAP1a、vJS-cHS4-△LAP1b、vJS-CMVp-△LAP1、vJS-△LAP1/P2和vJS-cHS4-△LAP1/P2）。进一步对亲本病毒JS-2012和突变病毒的体外生物学特性进行比较研究,结果显示:突变病毒在空斑大小和形态上都与亲本病毒没有显著差异。病毒一步生长曲线表明,各突变病毒与亲本病毒的复制动力学特征基本一致。进一步,我们对突变病毒的潜伏相关转录本表达特征进行了分析,发现启动子缺失病毒在感染的Vero细胞中存在LLT内部ORF1和ORF2基因的转录,在小鼠脑组织和三叉神经组织也能检测到LLT的表达,表明LLT启动子的缺失并没有造成LLT转录的完全关闭。但LLT启动子缺失使LLT内含子中编码的多种miRNA（miR-2-3’、miR-5和miR-9-3’）分子的转录水平显著降低,表明LLT启动子对该区域的miRNA分子转录存在调控作用,但是LLT启动子调控病毒miRNA分子表达所产生的生物学意义还需要进一步的研究确定。综上所述,本研究利用BAC/galK反向遗传操作系统,以PRV JS-2012作为骨架,获得了一系列LLT启动子LAP1/P2突变的PRV病毒株,通过对各突变病毒株的体内外生物学特性分析,发现LLT启动子突变不能显著影响病毒的体内外生物学特性,也不能关闭LLT内部ORF1和ORF2基因的转录。但是LLT启动子的缺失,会显著下调病毒LLT内含子内部多个miRNA分子的转录。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 伪狂犬病概述
•     1.1.1 伪狂犬病
•     1.1.2 伪狂犬病病毒的历史
•   1.2 伪狂犬病病毒的分子生物学
•     1.2.1 伪狂犬病病毒结构特征
•     1.2.2 疱疹病毒的复制
•     1.2.3 伪狂犬病病毒感染机制
•   1.3 伪狂犬病病毒潜伏感染研究进展
•   1.4 疱疹病毒miRNA研究进展
•   1.5 BAC/galK重组系统原理与应用
•   1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 LLT启动子缺失突变病毒的构建拯救及其体外生物学特性分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 病毒、细胞、质粒和菌株
•     2.1.2 主要工具酶和试剂
•     2.1.3 主要仪器设备
•     2.1.4 常用试剂的配制
•     2.1.5 常用培养基的配制
•     2.1.6 本章节引物设计
•     2.1.7 缺失LLT启动子突变病毒相关供体质粒的构建
•     2.1.8 正筛选SW102-BAC-galk的构建
•     2.1.9 负筛选系统
•     2.1.10 突变病毒拯救
•     2.1.11 突变病毒体外生物学特性分析
•   2.2 结果
•     2.2.1 pB-L1-R1质粒的构建及鉴定
•     2.2.2 pB-L1-cHS4-R1质粒的构建及鉴定
•     2.2.3 pB-L1-cHS4-R2质粒的构建与鉴定
•     2.2.4 pB-L1-CMVp-R1质粒的构建及鉴定
•     2.2.5 pB-L1-BGH-R3 质粒的构建及鉴定
•     2.2.6 pB-L1-cHS4-BGH-R3质粒的构建及鉴定
•     2.2.7 GalK基因的获得
•     2.2.8 正筛选SW102-BAC-galk鉴定结果
•     2.2.9 负筛选SW102-BAC-△LAP1鉴定结果
•     2.2.10 负筛选SW102-BAC-cHS4-△LAP1a鉴定结果
•     2.2.11 负筛选SW102-BAC-cHS4-△LAP1b鉴定结果
•     2.2.12 负筛选SW102-BAC-CMVp-△LAP1鉴定结果
•     2.2.13 负筛选SW102-BAC-△LAP1/P2 鉴定结果
•     2.2.14 负筛选SW102-BAC-cHS4-△LAP1/P2鉴定结果
•     2.2.15 拯救突变病毒
•     2.2.16 突变病毒体外生物学特性分析结果
•   2.3 讨论
• 第三章 启动子缺失突变病毒体内外转录 LLT相关分子的特征分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 病毒与细胞
•     3.1.2 工具酶、试剂、仪器设备以及培养基
•     3.1.3 实验动物
•     3.1.4 本章节引物设计
•     3.1.5 突变病毒感染Vero细胞LLT表达特征的研究
•     3.1.6 双缺失启动子突变病毒感染小鼠致病性及其组织中LLT表达特征研究
•     3.1.7 突变病毒感染Vero细胞miRNA表达特征的研究
•   3.2 结果
•     3.2.1 突变病毒感染Vero细胞LLT表达特征
•     3.2.2 双缺失启动子突变病毒感染小鼠致病性实验
•     3.2.3 双缺失启动子突变病毒感染小鼠组织的LLT表达特征
•     3.2.4 JS-2012感染Vero细胞miRNA表达特征
•     3.2.5 突变病毒感染Vero细胞miRNA表达特征
•   3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 陈静

导师: 郑浩

关键词: 伪狂犬病病毒,潜伏相关转录物,潜伏相关转录物启动子

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.65

总页数: 75

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