周泽琴朱丽珊周瑜人罗维东侯桂好张素中（通讯作者）
（中山大学新华学院广东广州510520）
【摘要】目的通过星点设计-响应面法优化松针总黄酮的最佳提取工艺。方法采用高效液相色谱法，紫外可见分光光度法及干燥失重测定法多指标综合评价松针中总黄酮的提取工艺，根据以上三种方法分别得出的黄酮浓度以及浸膏重量，权重系数为6：3：1，以提取时间，提取次数以及料液比为考察因素，用星点设计-响应面法优选出松针中总黄酮的提取工艺。结果松针中提黄酮提取工艺为提取时间1.80h、提取次数3次和料液比为18.88。结论所建立的总黄酮提取方法准确度，精密度和重现性较好；所建立的模型能很好预测松针中总黄酮的提取效果，准确度和重现性好。
【关键词】松针总黄酮高效液相色谱法紫外分光光度法星点设计-响应面法
【中图分类号】R914【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）32-0153-02
松科植物马尾松广泛分布于秦岭以南地区,是我国最重的松科植物之一。其叶松针具有祛风活血、明目安神、解毒、止痒等功效,广泛用于食品保健品等方面[1]。已有报道[2-3],松针含有大量的多元酚类、生物黄酮、生物碱、甾体皂苷等物质,其中的黄酮类化合物具有活泼的羟基氢而具有抗氧化性，能够抑制脂质过氧化作用、血小板凝聚、毛细管渗透性，以及环氧合酶和脂肪氧合酶等的活性[4-5]。笔者利用星点设计-响应面法优选出松针中总黄酮的提取工艺,为进一步开发和利用松针资源提供理论依据。
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）电子天平（上海精密仪器有限公司）电热恒温鼓风干燥箱（天津市中环实验电炉有限公司）
1.2试药
芦丁对照品（100080）,槲皮素对照品(95134)中国药品生物制品鉴定所；山奈酚对照品（120106）、穗花双黄酮对照品（120210）上海融禾医药科技有限公司；马尾松针（广州市天河区银排岭，经鉴定均为松科植物马尾松）
2方法
2.1高效液相色谱法同时测定其中4种黄酮含量
2.1.1色谱条件
色谱柱:AgilentC18(4.6×250mm，5μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)进行梯度洗脱：0～6min：A（20→30）,6～18min：A（30→35），18～30min：A（35→55）；流速为1.0mL/min；柱温为室温；检测波长365nm；进样量10μL。
2.1.2系统适用性试验
按照上述色谱条件，分别进样20μL，记录色谱图。理论板数分别为17350、12750、14105和11479，分离度分别为17.79、1.83、9.93和3.82，见图a、b。
图a对照品色谱图（1芦丁；2槲皮素；3山奈酚；4穗花双黄酮）
图b供试品色谱图
2.2紫外分光光度法测定总黄酮含量
精密量取芦丁对照品溶液2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0mL，分别置25mL量瓶中，分别加30%乙醇6mL，5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，室温放置6分钟;加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，室温放置6min;分别加4%氢氧化钠溶液10mL，加30%乙醇至刻度，摇匀，室温放置15min，在510nm测定吸光度。得线性回归方程A=9.795C（r2=0.9997），线性范围为0.016-0.056mg/ml
2.3干燥失重测定法测定浸膏得率
按10版《中国药典》干燥失重测定法，精密吸取滤液10mL，水浴蒸干，105℃烘干至恒重，制得干膏，再转移至干燥器中冷却至室温，精密称定，计算干浸膏得率。
3星点设计-响应面法优选工艺
3.1单因素实验
3.1.1料液比考察
取阴干的松针25g五份，分别用10、15、20、25、30倍量蒸馏水加热回流1h，提取液浓缩至25mL，即1g生药/ml。结果料液比对松针中总黄酮的提取相对明显，料液比为15的时候，两指标均出现明显的上升，但当料液比增加至25倍时，黄酮浓度不再增加，浸膏得率开始平稳，因此确定提取的料液比为15-25倍。
3.1.2提取时间考察
取阴干的松针25g五份，加水500mL，加热回流,分别提取30,60,90，120，150min提取1次，提取液浓缩至25mL。结果随着提取时间的增加，总黄酮浓度随之升高明显，在0.5-1h不断呈上升的趋势，曲线在2h达到峰值。考虑到每次提取时间的延长将增加成本，故确定提取时间的范围为1-2h。
3.1.3提取次数考察
取阴干的松针25g五份，加水500mL，加热回流1次，每次1h，合并提取液，浓缩至25ml。同法操作提取2，3，4次，浓缩至25mL。结果提取次数对松针中总黄酮的提取影响较大，考虑到成本，经过4次的提取，目标成分提取量增幅较小，提示提取量较完全，故确定提取次数范围为2-4次。
3.2星点设计
3.2.1试验设计及安排
根据单因素试验结果，设置提取次数、提取时间、料液比范围分别为2-4次(即以3次为中心点)、1-2h(即以1.5h为中心点)和15～25倍量(即以20倍量为中心点)，以液相测得黄酮浓度，紫外测得总黄酮浓度及浸膏得率权重比为6:3:1后的加权分数(Y)为效应变量。使用Design-expert软件(Rev7.1.3)进行星点试验安排，共计20次试验(中心点重复进行6次)，因素水平表如下。
表1星点设计因素水平表
3.2.2模型拟合及预测
使用designexpert软件对以上因素和效应值数据进行数学模型拟合，根据拟合结果选择二次多项式方程拟合为Y=-2.23160+0.17827X1+1.52098X2+0.14410X3+0.022345X1X2-7.33977E-003X1X3-0.029812X2X3-3.84142E-003X12-0.27277X22-1.69766E-003X32(r=0.8932P=0.0151)。去除二项式方程中p值最大项X12（P=0.9071）,由软件重新拟合，得Y=-2.18860+0.15522X1+1.51641X2+0.14349X3+0.022345X1X2-7.33977E-003X1X3-0.029812X2X3-0.27124X22-1.68240E-003X32(r=0.8932P=0.006)。重新拟合后可见，可信度（P明显增高，更加符合数据的分析.故采用拟合后的方二项式方程进行分析。
3.2.3方差分析
对以上拟合的二次方程函数的各项系数进行方差分析，结果见表2。
表2方差分析结果
3.2.4响应面分析
为了更为直观地展示X1、X2和X3三因素与效应值Y之间的变化关系，利用软件绘制了3个变量组成的二次方程函数在X1、X2和X3取值范围内的三维效应图，并以此预测出最佳效应值点及其对应参数X1、X2和X3值，三维效应图见图c。
图c综合效应量的三维效应图
由图c可知，提取时间在由小变大的过程中,Y值是先减小后增大；提取次数在由小变大的过程中,Y值也是先增大后减小；料液比在由小变大的过程中,Y值也是先减小后增大，整个效应面呈圆顶状，可以直观地找出Y值最大点。根据上述二项式及响应面三维图显示，提取次数3次与4次差异较小，结合实际生产成本，提取3次较为合适。
4工艺验证
为进一步验证考察优选工艺的可靠性及稳定性，按上述优选工艺条件（提取时间1.8h、提取3次和料液比为19）提取5份样品，每份40g，进行试验。验证结果与实验结果基本一致，表明该提取工艺科学、稳定、可行。
5结果与讨论
5.1本研究采用了星点-响应面设计方法，避免了均匀设计和正交设计不能预测因素在一个区间范围内连续取值的缺陷，同时星点设计能更好保证实验的精密度，预测性良好。
5.2本研究采用高效液相色谱法测定指标黄酮类成分含量、紫外可见分光光度法测定总黄酮量及干燥失重测定法提取物总固形为含量，并采用三种结果进行综合评价松针总黄酮提取方法的工艺条件，更为客观科学。
参考文献
[1]王巍，王晓华等.[J]马尾松松针的黄酮类化学成分的分离鉴定,中国医院药学杂志,2008(7):549-522.
[2]毕跃峰,郑晓珂,冯卫生,等.松针的研究进展及开发利用[J].河南中医药学刊,1999(2):14-17.
[3]李萍,刘友平.松针研究进展[J].成都中医药大学学报,2001,(3):49-50.