犬细小病毒分离鉴定及非结构蛋白NS1致炎作用的研究

论文摘要

犬细小病毒病（Canine parvovirus disease）是犬细小病毒（Canine parvovirus,CPV）引起的一种以出血性肠炎和心肌炎为主要发病特征的高接触性急性传染病,并伴有剧烈呕吐、便血、食欲不振、精神沉郁等临床症状。CPV呈世界流行,在我国已经成为犬类三大传染病之一,已经成为犬病研究热点。当下对该病感染机制的研究不足,对其侵染宿主细胞后影响宿主细胞免疫反应研究较少,因此,CPV感染机制的研究变得迫在眉睫。本研究对CPV感染后炎症反应过程中参与的各类细胞因子的研究,开展了以下试验:1.收集CPV胶体金试纸检测阳性的病犬粪便,进行病毒分离鉴定并对其全基因组测序。结果表明,成功分离出一株CPV,并完成全基因组测序,经VP2氨基酸序列分析,鉴定为New CPV-2b亚型,该分离株病毒TCID50为10-4.85/0.1mL;血凝效价为1∶256;与国内17株参考毒株全基因序列核苷酸同源性为96.4%99.9%,其中与北京分离毒株高度同源为99.9%。2.利用荧光定量PCR技术检测CPV感染F81细胞不同时间点细胞内炎性因子的转录时相,结果显示,CPV感染F81细胞前期引起IL-2表达水平明显上升,IL-4水平无变化,证明病毒感染后引起Th1型免疫应答;随后检测IL-6和TNF-α的mRNA水平较空白对照组水平明显发生变化,在感染的前期表达水平明显上调,中期出现下降趋势,后期再次发生上调,同时抑炎细胞因子IL-10和TGF-β在IL-6与TNF-α表达上调时明显受到激活,在IL-6与TNF-α表达下调时明显呈现下降趋势,这与炎症反应中,炎性因子的动态平衡相吻合。3.为了确定CPV非结构蛋白NS1在病毒侵染过程中起着什么作用,将非结构蛋白NS1基因克隆并通过双酶切法与pEGFP-N1真核表达载体连接,成功构建pEGFP-N1-NS1重组质粒,将重组质粒通过脂质体介导法转染入293T细胞中,使用EGFP荧光标签更快捷高效的检测重组质粒的转染效率及表达情况。4.重组质粒转染293T细胞,利用荧光定量PCR技术检测转染后各时间点细胞内相关炎性因子转录时相。结果显示,在转染前期细胞内IL-2在mRNA水平明显上升,IL-4表达水平并无明显变化,证明NS1在转染后引起细胞Th1免疫应答;随后检测IL-6和TNF-α的mRNA水平较空白对照组及空载对照组水平明显发生变化,在感染的前期表达水平明显上调,中期出现下降趋势,后期再次发生上调。本试验初步探究了病毒感染过程中CPV与宿主细胞相互作用及效应,为CPV的感染机制研究及临床预防提供了理论依据,具有一定的应用价值。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
•   第一章 犬细小病毒概述
•     1.1 犬细小病毒分子生物学研究
•     1.2 犬细小病毒遗传进化
•     1.3 犬细小病毒病理学研究
•     1.4 犬细小病毒预防
• 第二篇 研究内容
•   第一章 CPV河南株的分离鉴定及全基因组序列分析
•     1.1 材料和方法
•     1.2 结果
•     1.3 讨论
•     1.4 小结
•   第二章 CPV感染F81 细胞致炎作用的研究
•     2.1 材料与方法
•     2.2 结果
•     2.3 讨论
•     2.4 小结
•   第三章 CPV非结构蛋白NS1 真核表达载体的构建与转染
•     3.1 材料与方法
•     3.2 结果与分析
•     3.3 讨论
•     3.4 小结
•   第四章 非结构蛋白NS1对细胞致炎作用的研究
•     4.1 材料与方法
•     4.2 结果
•     4.3 讨论
•     4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐磊

导师: 蔡亚南

关键词: 犬细小病毒,型免疫应答,炎性细胞因子,非结构蛋白

来源: 吉林农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 吉林农业大学

基金: 国家自然科学基金项目(31772722),中国博士后科学基金面上项目(2014M561308),吉林省科技厅项目(20160520180JH),吉林省教育厅项目

分类号: S852.655

DOI: 10.27163/d.cnki.gjlnu.2019.000529

总页数: 58

文件大小: 1373K

下载量: 126