飞蝗蜕皮发育关键基因的分子特性及功能研究

论文摘要

昆虫的蜕皮由蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）和保幼激素（Juvenile hormone,JH）协同调控。蜕皮激素通过与蜕皮激素受体EcR（Ecdysteroid receptor）和超气门蛋白USP（完全变态昆虫中称为Ultraspiracle protein,渐变态昆虫中称为RXR,Retinoid X receptor,维甲类X受体）的复合物结合,进而调控一系列下游转录因子的表达,从而调控蜕皮和变态等生理过程。蜕皮激素受体EcR的亚型EcR-B1入核需要GTP酶Ran和核转运因子2（Nuclear Transport Factor 2,NTF2）的参与。而蜕皮过程中伴随几丁质的合成和降解,磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶（Phosphoacetylglucosamine mutase,PAGM）是几丁质合成的关键酶之一。本文以飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象,对上述蜕皮发育过程中4个基因（LmRXR、LmRan、LmNTF2和LmPAGM）的分子特性及其生物学功能进行研究,主要研究结果如下:1)克隆获得LmRan和LmNTF2基因cDNA开放阅读框全长序列,分别编码215个氨基酸和130个氨基酸。通过RT-qPCR方法分析LmRan和LmNTF2在五龄飞蝗不同组织部位及不同发育龄期的mRNA表达,结果表明,LmRan在前肠、翅芽、精巢和卵巢中的表达量较高,且在每个龄期均表达。LmNTF2在五龄飞蝗第1天表达最高,且在胃盲囊、中肠及后肠高表达。运用RNAi技术研究这两个基因的功能,结果表明沉默LmRan致使飞蝗100%蜕皮前死亡,且在飞蝗若虫-若虫蜕皮和若虫-成虫变态过程中均具有重要作用。但是沉默LmNTF2并未观察到可见表型。注射dsLmRan后飞蝗体壁无皮层溶离,无新表皮的形成;体重较对照组显著下降,且胃盲囊严重萎缩。进一步利用RT-qPCR方法分析发现沉默LmRan 48 h后,参与20E合成的CYP家族基因LmCYP302a1、LmCYP315a1和LmCYP314a1及几丁质代谢关键基因LmGfat和LmCHT10的表达显著下调。2)根据NCBI已公开的LmRXR-L和LmRXR-S cDNA序列（GenBank登录号:AAQ55293.1和AAF00981.1）,采用RT-qPCR方法分别对LmRXR-L和LmRXR-S的mRNA表达特性进行分析,结果表明,两者均在精巢和卵巢高表达,且在五龄第2-3天高表达。RNAi实验表明LmRXR在飞蝗蜕皮和变态过程中均起到重要作用。注射dsLmRXR飞蝗体壁仍经历皮层溶离,旧表皮降解新表皮形成的过程;且新表皮的几丁质层状结构与对照组相比无显著变化;几丁质含量亦无明显差异。进一步利用RT-qPCR方法分析发现沉默LmRXR 48 h后,除LmCYP302a1下调和LmFTZ-F1上调外,其他基因的表达均未受到影响。3)克隆获得LmPAGM基因的cDNA开放阅读框全长序列,编码497个氨基酸。mRNA表达分析表明LmPAGM在五龄飞蝗不同组织均衡表达且在第8天显著高表达。RNAi实验表明注射dsLmPAGM组中LmPAGM的表达较对照组显著下调,并且约30%的飞蝗无法成功羽化为成虫,表明LmPAGM对飞蝗蜕皮起重要作用。本文的研究结果为深入解析飞蝗蜕皮发育的分子调控机制奠定了基础数据,同时为飞蝗防治提供了新的分子靶标。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1 昆虫生长发育的激素调控
•   2 蜕皮激素受体EcR研究概述
•   3 GTP酶 Ran及核转运因子2（NTF2）研究概述
•   4 昆虫超气门蛋白USP和维甲酸X受体RXR来源及研究概述
•   5 昆虫表皮结构
•   6 磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶PAGM研究概述
•   7 研究目的及意义
• 第二章 飞蝗GTP酶 Ran及核转运因子2（NTF2）基因的分子特性及功能研究
•   1 实验材料
•     1.1 供试昆虫
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要实验仪器
•   2 实验方法
•     2.1 LmRan与 LmNTF2 的序列分析
•       2.1.1 LmRan与 LmNTF2 基因序列的获取及分析
•       2.1.2 Ran氨基酸比对及聚类树构建
•     2.2 LmRan与 LmNTF2 基因在不同组织和发育时期的表达
•       2.2.1 RNA的提取
•       2.2.2 cDNA模板的制备
•       2.2.3 引物设计
•       2.2.4 RT-qPCR
•     2.3 LmRan RNAi对飞蝗若虫-成虫变态发育的研究
•       2.3.1 dsRNA的体外合成、注射以及观察
•       2.3.2 沉默效率检测
•       2.3.3 体壁H&E染色
•       2.3.4 体重称量及肠道解剖观察
•       2.3.5 LmRan RNAi对20E信号级联通路基因表达的影响
•     2.4 LmRan RNAi对飞蝗若虫-若虫蜕皮的影响
•     2.5 LmNTF2 基因的功能研究
•   3 实验结果
•     3.1 LmRan及 LmNTF2 基因的序列分析
•       3.1.1 LmRan基因的序列分析
•       3.1.2 LmNTF2 基因的序列分析
•     3.2 不同物种Ran的氨基酸比对
•     3.3 不同物种Ran的聚类分析
•     3.4 LmRan基因在不同组织和发育时期的表达分析
•     3.5 LmNTF2 基因在不同组织及发育时期的表达分析
•     3.6 LmRan RNAi对飞蝗若虫-成虫变态的影响
•       3.6.1 LmRan RNAi后沉默效率检测及表型观察
•       3.6.2 LmRan对飞蝗体重及肠道的影响
•       3.6.3 LmRan RNAi后体壁切片组织学观察
•       3.6.4 LmRan RNAi对20E信号级联通路基因表达的影响
•     3.7 LmRan RNAi对飞蝗若虫-若虫蜕皮的影响
•     3.8 LmNTF2 RNAi沉默效率检测及表型观察
•   4 讨论
• 第三章 飞蝗LmRXR基因的分子特性及功能研究
•   1 实验材料
•     1.1 供试昆虫
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要实验仪器
•   2 实验方法
•     2.1 LmRXR基因的序列分析
•       2.1.1 LmRXR基因c DNA序列的获取及验证
•       2.1.2 LmRXR基因结构分析
•     2.2 LmRXR基因在不同组织部位及发育时期的表达
•     2.3 LmRXR RNAi对飞蝗若虫-成虫变态的研究
•       2.3.1 dsRNA的体外合成、注射以及观察
•       2.3.2 沉默效率检测
•       2.3.3 体壁H&E染色、超微结构观察及几丁质含量的测定
•       2.3.4 体重称量及肠道解剖观察
•       2.3.5 LmRXR RNAi对20E信号级联通路相关基因表达的影响
•     2.4 LmRXR RNAi对飞蝗若虫-若虫蜕皮发育的研究
•   3 实验结果
•     3.1 LmRXR基因c DNA序列验证及结构预测
•     3.2 LmRXR基因在不同组织及发育时期的表达分析
•     3.3 LmRXR RNAi对飞蝗若虫-成虫变态的影响
•       3.3.1 LmRXR RNAi后沉默效率及表型观察
•       3.3.2 体壁切片组织学观察及几丁质含量检测
•       3.3.3 沉默RXR对飞蝗体重及肠道的影响
•       3.3.4 20E信号通路及几丁质代谢相关基因的表达检测
•     3.4 LmRXR RNAi对若虫-若虫蜕皮的影响
•   4 讨论
• 第四章 飞蝗磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶PAGM基因的分子特性及功能研究
•   1 实验材料
•     1.1 供试昆虫
•     1.2 主要试剂及仪器
•   2 实验方法
•     2.1 LmPAGM基因c DNA序列及基因组序列获得
•     2.2 LmPAGM基因在不同组织部位及发育时期的表达
•       2.2.1 RNA提取及c DNA制备
•       2.2.2 RT-qPCR
•     2.3 RNAi分析LmPAGM的功能
•       2.3.1 dsRNA的体外合成
•       2.3.2 dsRNA的注射
•       2.3.3 LmPAGM沉默效率检测
•   3 结果
•     3.1 LmPAGM c DNA的序列及基因组结构分析
•     3.2 LmPAGM在不同组织部位的表达分析
•     3.3 五龄期不同发育天数LmPAGM的表达分析
•     3.4 LmPAGM的生物学功能分析
•   4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张政

导师: 张建珍,刘晓健

关键词: 飞蝗,维甲酸受体,核转运因子,磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶,功能

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 山西大学

分类号: Q963;Q78

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.001569

总页数: 85

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