大肠杆菌植酸酶appA的定向改造

论文摘要

植酸酶是一类能将植酸及植酸盐降解为肌醇和磷酸（或磷酸盐）的酶的统称。植酸即肌醇六磷酸（myo-Inositol hexakisphosphate,IP6）,是植物种子中磷元素的主要储存形式。植酸是植物性饲料中存在的主要抗营养因子之一,对金属离子、蛋白质等都具有螯合作用,从而影响动物对营养物质的吸收。同时,磷作为动物生长与繁殖必需的矿物因素之一,单胃动物因缺乏分解植酸所必需的酶而不能有效利用植酸磷。植酸酶作为一种重要的饲料添加剂可以解决上述问题。在饲料生产的制粒过程中,植酸酶需要经过高温加热,如何提高植酸酶的热稳定性成为研究热点。植酸酶主要在动物的消化系统内起作用,消化系统内存在大量的蛋白酶。对蛋白酶的敏感性是制约植酸酶商业化应用的重要因素。本研究通过基因工程手段对大肠杆菌植酸酶appA进行定向改造,提高了植酸酶appA的热稳定性及蛋白酶的耐受性,并初步探讨了植酸酶结构与功能的关系,获得以下主要结果:1、N-糖基化对植酸酶appA的影响N-糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰。在毕赤酵母中表达后,植酸酶存在N-糖基化修饰现象。通过序列分析及结构模拟后发现,植酸酶appA中有三个N-糖基化位点（N139、N204和N317）,分别位于α-螺旋、β-片层和无规则卷曲上。为研究N-糖基化修饰对大肠杆菌植酸酶appA酶学性质的影响,本研究设计了一系列N-糖基化植酸酶突变体基因并转入毕赤酵母中进行了表达与纯化,并对野生型植酸酶appA-WT与N-糖基化植酸酶突变体进行了酶学性质的研究与比较。结果表明:相对较稳定的N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5分子量约为60 kDa,酶活为3187 U/mg,Km=445μmol/L,Vmax=3654 U/mg。植酸酶突变体appA-Mut5最适pH值为4.5,与野生型植酸酶appA-WT的最适pH无明显区别,最适反应温度为65°C,比野生型植酸酶appA-WT的最适温度提高了5°C,Tm值提高约11°C。经75°C处理15 min后,野生型植酸酶appA-WT丧失89%的活性,而完全去除N-糖基化位点的植酸酶突变体appA-Mut3在此处理后完全失活,N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5则仍能保持43%的残余活性。N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5不仅具有良好的热稳定性,并且对蛋白酶的耐受性也高于野生型植酸酶appA-WT及其他植酸酶突变体。基于实验设计,N-糖基化植酸酶突变体appA-Mut5上共有八个潜在的N-糖基化位点。利用LC-MS/MS技术确认了植酸酶突变体appA-Mut5上的N-糖基化位点数目和每个N-糖基化位点上所连的糖链。LC-MS/MS质谱检测结果表明:植酸酶突变体appA-Mut5上的六个位点（N74、N139、N171、N204、N317、N349）为N-糖基化位点,每个N-糖基化位点表现出不同的N-糖基化程度且所连的糖链不同;而覆盖N258和N282这两个N-糖基化潜在位点的糖肽没有被检测到。以上结果表明:N-糖基化修饰具有不均一性且对植酸酶appA的稳定性有促进作用。同时,本研究也确定新引入的三个位点（N74、N171和N349）可被酵母识别从而进行N-糖基化修饰,为植酸酶的定向改造奠定了基础。2、合理设计提高植酸酶appA的胰蛋白酶耐受性前期研究表明,植酸酶appA对胃蛋白酶具有很好的耐受性,但对胰蛋白酶较为敏感。为提高大肠杆菌植酸酶appA的胰蛋白酶的耐受性,本研究采用基于结构的合理性策略选择位于loop区的六个易受胰蛋白酶攻击的作用位点（K74、K75、K180、R181、K183和K363）作为候选位点。通过结构模拟和氢键分析,确定在植酸酶appA上突变K74D、K75Q、K180N、R181N、K183S和K363N这六个位点,获得了植酸酶突变体appA-M6。结果表明,纯化后的appA-M6具有酶活为3262 U/mg,分子量约为52-55 kDa。与野生型植酸酶appA-WT相同,appA-M6的最适pH（4.5）和最适温度（60°C）不变。与野生型植酸酶appA-WT相比,appA-M6对胰蛋白酶的抗性显著增强,Tm值升高3.8°C。由于新的突变位点的引入,植酸酶appA中增加了新的氢键,导致植酸酶的柔韧性降低,从而提高了植酸酶胰蛋白酶的耐受性和热稳定性。3、多位点组合突变获得热稳定性好且具有良好蛋白酶耐受性的植酸酶为获得热稳定性好,又具有蛋白酶耐受性的植酸酶,基于前期的研究结果,我们设计并表达纯化了野生型植酸酶appA-WT和植酸酶突变体appA-M8、appA-M10、appA-M12、appA-M15和appA-M16,分别测定比较了它们的酶学性质。通过筛选,最终确定突变位点的最佳组合为:W46E、Q62W、A73P、K74N、K75Q、G76T、S146E、R159Y、P173S、K180N、R181N、K183S、N204C、Y255D、Q349N、K365N这十六个位点,获得酶学性质最佳的植酸酶突变体appA-M16。植酸酶突变体appA-M16经80°C处理25 min后仍有40%以上的剩余活性,而appA-WT完全失活。植酸酶突变体appA-M16不仅热稳定性较好,而且胰蛋白酶的耐受性也获得了改善。对植酸酶突变体appA-M16中的N-糖基化修饰进行了检测,质谱的检测结果证明:新引入的三个N-糖基化位点（N74、N171和N349）确实发生了N-糖基化修饰。与野生型植酸酶appA-WT相比,植酸酶突变体appA-M16结构发生了改变。由于引入了新的氢键和N-糖基化修饰,其结构的刚性增强,植酸酶的构象更加稳定,从而改善了植酸酶的热稳定性及蛋白酶的抗性。本研究通过组合突变及最优位点筛选成功获得了一个热稳定提高及耐胰蛋白酶的植酸酶突变体appA-M16,并探讨了植酸酶结构稳定的分子机理,为定向改造植酸酶提供了一定的理论基础,筛选出的植酸酶突变体菌株具有良好的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 植酸酶概述
•   1.2 植酸酶的来源及分类
•   1.3 植酸酶的蛋白质工程
•     1.3.1 提高植酸酶的热稳定性
•     1.3.2 改善植酸酶的最适pH
•     1.3.3 提高植酸酶的蛋白酶耐受性
•     1.3.4 改善植酸酶的表达量
•   1.4 植酸酶的应用
•     1.4.1 动物饲料
•     1.4.2 转基因植物
•     1.4.3 乙醇制造业
•   1.5 本课题的设计思路
•   1.6 本课题的创新点
• 第二章 N-糖基化对大肠杆菌植酸酶appA的影响
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株和质粒
•     2.1.2 试剂、酶和试剂盒
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 真核表达载体的构建
•     2.2.2 毕赤酵母真核表达体系的建立
•     2.2.3 重组植酸酶的表达纯化及脱糖基化
•     2.2.4 植酸酶酶活的测定
•     2.2.5 重组植酸酶的酶学性质测定
•     2.2.6 蛋白酶的耐受性
•     2.2.7 重组植酸酶的结构变化比较
•     2.2.8 SWISS-MODEL模拟分析
•     2.2.9 N-糖基化位点的鉴定及糖链分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 表达载体pPIC9-appA-Mut1、pPIC9-appA-Mut2、pPIC9-appA-Mut3、pPIC9-appA-Mut4和pPIC9-appA-Mut5 的构建
•     2.3.2 重组植酸酶的表达纯化及去糖基化分析
•     2.3.3 酶学性质的比较
•     2.3.4 蛋白酶耐受性比较
•     2.3.5 结构差异性比较
•     2.3.6 植酸酶突变体appA-Mut5的N-糖基化修饰的质谱鉴定
•   2.4 讨论
• 第三章 合理设计提高大肠杆菌植酸酶appA的胰蛋白酶耐受性
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 试剂、酶和试剂盒
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 真核表达载体的构建
•     3.2.2 毕赤酵母真核表达体系的建立
•     3.2.3 重组植酸酶的表达纯化及脱糖基化
•     3.2.4 蛋白酶的耐受性
•     3.2.5 重组植酸酶的酶学性质测定
•     3.2.6 统计分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 合适的胰蛋白酶作用位点的选择
•     3.3.2 表达载体pPIC9-appA-M2、pPIC9-appA-M5和pPIC9-appA-Mut6 的构建
•     3.3.3 重组植酸酶的表达纯化及去糖基化分析
•     3.3.4 蛋白酶耐受性比较
•     3.3.5 酶学性质的比较
•     3.3.6 圆二色光谱分析
•   3.4 讨论
• 第四章 多位点组合突变改善大肠杆菌植酸酶appA的酶学性质
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 试剂、酶和试剂盒
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 真核表达载体的构建
•     4.2.2 毕赤酵母真核表达体系的建立
•     4.2.3 重组植酸酶的表达纯化及脱糖基化
•     4.2.4 重组植酸酶的酶学性质测定
•     4.2.5 蛋白酶的耐受性
•     4.2.6 重组植酸酶的结构变化比较
•     4.2.7 N-糖基化位点的鉴定
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 表达载体pPIC9-appA-M10、pPIC9-appA-M12、pPIC9-appA-M15 和pPIC9-appA-M16的构建
•     4.3.2 重组植酸酶的表达纯化及去糖基化分析
•     4.3.3 酶学性质的比较
•     4.3.4 蛋白酶耐受性比较
•     4.3.5 LC-MS/MS检测appA-M16的N-糖基化修饰
•     4.3.6 结构差异性比较
•   4.4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 附录1 缩略语
• 附录2 主要仪器设备
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王茜

导师: 梁爱华

关键词: 植酸酶,糖基化,热稳定性,胰蛋白酶耐受性,毕赤酵母

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山西大学

分类号: Q78

总页数: 117

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