传染性法氏囊病病毒吸附受体的鉴定及致炎机制研究

论文摘要

鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种严重危害世界养禽业的疾病,该病被世界动物卫生组织（OIE）列为重要家禽疫病之一。1990年以后,IBD的防控局势发生了巨大改变,不同毒力的传染性法氏囊病病毒（IBDV）毒株开始出现。超强毒（vvIBDV）主要在我国流行,导致炎症、免疫抑制及幼鸡的高死亡率。研究IBDV的致病机制,找到防控重点,对于疾病防治具有重要意义。目前对于IBDV具体致病机制的研究仍不全面,本研究主要从IBDV病毒吸附及致炎机理两个方面,对IBDV致病机制进行进一步探索。病毒感染的第一个步骤就是与受体结合并进入细胞,目前已知IBDV VP2蛋白是决定病毒与细胞结合及细胞嗜性的主要病毒蛋白。为了找到IBDV可能受体,并更深入的了解IBDV复制过程,本实验通过质谱检测IBDV衣壳蛋白VP2的互作蛋白,筛选到膜蛋白CD74分子。免疫共沉淀实验验证了CD74胞外区与VP2的互作,并验证了CD74对于IBDV复制能力及吸附作用的影响。通过Western blot、qPCR及ELD50实验结果可见,病毒在CD74敲低细胞系中复制减弱,而CD74过表达则促进IBDV的复制。激光共聚焦实验表明CD74在非允许细胞中过表达可以使IBDV及SVP获得结合非允许细胞的能力,qPCR实验进一步证实CD74在非易感细胞上过表达可以使IBDV结合非易感细胞的拷贝数增加,说明该分子对于病毒吸附非允许细胞的重要作用。抗CD74抗体封闭、CD74可溶性蛋白封闭实验结果可见病毒吸附被抑制,并且IBDV吸附CD74敲低细胞系的能力显著下降,说明CD74对于IBDV结合靶细胞具有重要作用。本研究表明CD74是IBDV结合靶细胞B细胞淋巴系DT40的新型吸附受体,揭示了IBDV的复制早期机制。IBDV除了感染早期与受体的相互作用外,还可以被细胞表面模式识别受体等识别并启动一系列的炎症反应,IBDV感染早期的炎症反应主要体现在法氏囊中炎性细胞浸润及促炎症因子表达升高等方面。为了探索IBDV超强毒导致的急性炎症的原因,本研究首先探索了vvIBDV感染SPF鸡在不同时间点导致炎症反应、法氏囊损伤及死亡的具体情况,结果表明vvIBDV感染SPF鸡可以导致法氏囊前炎症因子IL-1β和IL-18的转录水平上调,病理检测可见法氏囊出现巨噬细胞及异嗜性细胞的浸润。iTRAQ实验筛选了IBDV超强毒与非致病弱毒感染原代B细胞差异表达炎症因子—巨噬细胞转移抑制因子（MIF）。为了验证MIF在IBDV导致炎症中的作用,首先通过qPCR及ELISA实验证实了vvIBDV感染导致MIF在体内及体外转录及表达水平的上调。qPCR及transwell实验结果可见,分泌的MIF蛋白可以促进外周血单个核细胞（PBMC）的迁移及巨噬细胞前炎症因子的转录上调,该现象可以被MIF抑制剂有效抑制。本实验证实了鸡MIF是vvIBDV介导炎症发生的重要原因之一,对于IBDV的致病机制研究及防控提供了重要线索,但IBDV的其它致炎机制仍需进一步进行研究。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 第一章 引言
•   1.1 传染性法氏囊病病毒（IBDV）研究进展
•     1.1.1 IBD概况
•     1.1.2 IBDV的流行病学
•     1.1.3 IBDV的基因组
•     1.1.4 IBDV编码蛋白功能
•       1.1.4.1 VP1蛋白
•       1.1.4.2 VP2蛋白
•       1.1.4.3 VP3蛋白
•       1.1.4.4 VP4蛋白
•       1.1.4.5 VP5蛋白
•     1.1.5 IBDV病毒复制过程
•     1.1.6 IBDV的致病性
•       1.1.6.1 宿主范围
•       1.1.6.2 临床症状和病理病变
•       1.1.6.3 靶细胞
•       1.1.6.4 免疫抑制
•       1.1.6.5 细胞凋亡
•       1.1.6.6 宿主免疫应答
•     1.1.7 IBDV的防控
•   1.2 IBDV受体研究进展
•   1.3 CD74分子研究进展
•   1.4 IBDV与炎症研究进展
•   1.5 巨噬细胞转移抑制因子研究进展
•   1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 IBDV吸附受体CD74的鉴定
•   2.1 材料和方法
•     2.1.1 毒株、细胞及抗体
•     2.1.2 仪器与设备
•     2.1.3 实验动物
•     2.1.4 免疫沉淀及质谱鉴定
•     2.1.5 RNA提取及荧光定量检测
•     2.1.6 重组蛋白真核表达及纯化
•     2.1.7 RNA干扰及过表达实验
•     2.1.8 免疫共沉淀实验
•     2.1.9 受体重建实验
•     2.1.10 受体封闭实验
•     2.1.11 激光共聚焦实验
•     2.1.12 CD74敲低细胞系的构建
•   2.2 结果
•     2.2.1 筛选CD74作为IBDV受体疑似分子
•     2.2.2 CD74下调抑制IBDV复制
•     2.2.3 CD74敲低细胞系的构建及敲除效率鉴定
•     2.2.4 CD74敲低显著抑制IBDV复制
•     2.2.5 CD74上调促进IBDV复制
•     2.2.6 CD74受体重建实验
•     2.2.7 CD74可溶性蛋白封闭抑制IBDV结合DT40细胞
•     2.2.8 CD74抗体抑制IBDV结合DT40细胞
•     2.2.9 CD74下调抑制IBDV结合DT40细胞
•     2.2.10 CD74上调促进IBDV结合DT40细胞
•   2.3 讨论
•   2.4 小结
• 第三章 IBDV超强毒通过上调MIF促进炎症反应
•   3.1 材料和方法
•     3.1.1 病毒及试剂
•     3.1.2 仪器与设备
•     3.1.3 实验动物
•     3.1.4 细胞
•     3.1.5 iTRAQ实验
•     3.1.6 病理检测
•     3.1.7 RNA提取及荧光定量PCR
•     3.1.8 ELISA
•     3.1.9 细胞迁移实验
•     3.1.10 CCK-8
•   3.2 结果
•     3.2.1 vvIBDV感染导致宿主炎症细胞迁移
•     3.2.2 vvIBDV感染导致宿主炎症因子上调
•     3.2.3 iTRAQ实验筛选炎症相关蛋白
•     3.2.4 IBDV超强毒感染导致鸡MIF上调
•     3.2.5 MIF使外周血单个核细胞迁移
•     3.2.6 IBDV感染DT40细胞上清使外周血单个核细胞迁移
•     3.2.7 IBDV感染通过产生MIF促进炎症细胞迁移
•     3.2.8 MIF导致巨噬细胞IL-1β/18 上调
•     3.2.9 vvIBDV感染B细胞上清导致巨噬细胞IL-1β/18 上调
•     3.2.10 vvIBDV感染通过分泌MIF促进IL-1β/18上调
•   3.3 讨论
•   3.4 小结
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘爱晶

导师: 王笑梅

关键词: 细胞受体,巨噬细胞转移抑制因子,炎症反应

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 国家自然基金重点项目(31430087),十三五国家重点研发计划项目(2016YFE0203200)

分类号: S852.65

DOI: 10.27630/d.cnki.gznky.2019.000061

总页数: 79

文件大小: 10462k

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