18S rDNA介导的桔青霉核酸酶P1表达载体的构建及表达分析

论文摘要

本研究采用黑曲霉Bdel4菌株为宿主菌,敲除gla A,aam A,An05g02100和An12g06930四个主要的胞外分泌蛋白,为核酸酶P1的表达和分泌提供通路。通过PCR扩增得到黑曲霉Bdel4的r DNA序列,构建了以r DNA序列为整合位点的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S,将构建的重组质粒p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S转入黑曲霉Bdel4。通过半荧光定量PCR进行转化子初筛,之后测定核酸酶P1的酶活复筛,选出一株高活性菌株用于工业生产。采用SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源目的基因nucP1的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数,探究其与酶活表达水平之间的联系。结果显示含9个nuc P1基因拷贝数的菌株的酶活水平达到88.5 U/mL,较核酸酶P1单拷贝菌株增加了3.86倍,较之前研究中异源表达核酸酶产量提高1.20倍,再增加nuc P1的拷贝数时,酶活水平随着拷贝数的增加而降低。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 质粒、菌种和主要试剂
•     1.1.2 培养基和培养方法
•     1.1.3 使用的仪器
•   1.2 方法
•     1.2.1 NP1基因的合成
•     1.2.2 p Rp T-nuc P1-18S和p Rp T-2A-nuc P1-18S质粒构建
•     1.2.3 转化子的筛选与发酵上清液的SDS-PAGE分析
•     1.2.4 核酸酶P1酶活测定
•     1.2.5 核酸酶P1的western blot分析
•     1.2.6 实时荧光PCR的体系和反应条件
•     1.2.7 表达菌株拷贝数的测定
• 2 实验结果
•   2.1 质粒构建
•   2.2 半定量PCR筛选重组菌株
•   2.3 菌株表达情况与核酸酶P1的酶活测定
•   2.4 黑曲霉表达核酸酶P1蛋白的Western blot检测
•   2.5 Bpnu-18S和Bp2A-18S拷贝数分析
• 3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 陈筱仪,王斌,潘力

关键词: 核酸酶,黑曲霉,实时荧光定量,拷贝数

来源: 现代食品科技 2019年06期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑,基础科学

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 华南理工大学生物科学与工程学院广东省发酵与酶工程重点实验室

基金: 国家自然科学基金项目(31871736,31870024),广东省自然科学基金(2017A030313097),广东省调味食品生物发酵先进技术企业重点实验室开放基金项目(2017B030302002)

分类号: Q78;TQ920.1

DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2019.6.019

页码: 145-153

总页数: 9

文件大小: 2907K

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