Bre1介导的组蛋白H2B泛素化在DNA同源重组修复中的作用和机制研究

论文摘要

DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,DSBs）是机体内最严重的DNA损伤类型之一。如果双链断裂不能及时修复,则有可能导致DNA片段缺失、插入,染色体重排和易位,造成基因组不稳定,最终诱使细胞发生癌变或死亡。双链断裂修复的机制在进化上比较保守,无论是在酵母还是高等真核生物中,细胞主要通过非同源末端连接（non-homologous end joining,NHEJ）和同源重组（homologous recombination,HR）两种方式来修复双链断裂。在DNA双链断裂修复过程中,染色质状态和组蛋白修饰发挥了重要的调控作用,但其具体功能和作用机制仍不完全清楚。在酿酒酵母中,Bre1蛋白是一个带有RING结构域的E3泛素连接酶,它能与E2泛素结合酶Rad6共同作用单泛素化组蛋白H2B的K123位点。研究发现,Bre1介导的H2B泛素化在DNA复制、转录、减数分裂、着丝粒稳定性、端粒末端加工方面均发挥重要的功能。最近研究发现bre1Δ突变体对于离子辐射敏感,暗示了Bre1蛋白在DNA损伤修复可能发挥重要功能。本文探究了Bre1在DNA双链断裂的同源重组修复中的功能及分子机制,取得的结果如下:1)与野生型细胞相比,bre1Δ突变体细胞对DNA损伤药物的持续性处理或短暂性处理均表现出显著的敏感性,存活率显著降低。进一步通过异位同源重组实验和基因打靶实验,我们发现BRE1敲除导致DNA双链断裂修复中同源重组效率显著下降。并且,我们发现Bre1是通过泛素化H2B来发挥作用的。相应地,ChIP-qPCR结果显示Bre1蛋白在DNA双链断裂发生后会被直接募集到损伤末端,刺激局部H2B泛素化水平上升。2)通过Southern Blot实验我们发现Bre1对两条末端加工通路均有明显的抑制作用。这是因为当BRE1敲除后,H3K79甲基化缺陷,Rad9不能被招募,从而解除了对末端剪切的负调控作用,导致剪切加快。然而在bre1Δ突变体中,HR修复缺陷并不是由于快速剪切导致的。3)通过ChIP-qPCR实验,我们发现无论是BRE1敲除或是H2B-K123泛素化缺失,均会导致ssDNA结合蛋白RPA复合物和重组酶Rad51在断裂末端募集量的显著下降。另一方面,染色质组分分离实验显示在bre1Δ突变体中,与染色质结合的Rad51含量明显降低,而游离的Rad51含量却显著上升。同时,通过ChIP-qPCR实验,我们发现bre1Δ突变体中组蛋白H3的移除效率减慢,因而我们推测Bre1介导的H2B泛素化通过促进组蛋白的移除来影响Rad51等修复蛋白的募集。4)为了验证上述推论,我们在bre1Δ突变体中过表达Rad51蛋白。结果发现Rad51的过表达既可以竞争性抑制组蛋白H3滞留在DNA双链断裂末端,也能够显著回复bre1Δ突变体的HR修复缺陷。此外,我们发现CAC1的敲除能够部分回复bre1Δ突变体的HR修复缺陷,这也暗示了Bre1在组蛋白移除上有着重要功能。5)与此同时,我们也探究了Bre1促进组蛋白移除的可能机制。一方面,我们发现了Bre1促进组蛋白的移除并不是通过促进剪切来完成的。另一方面,我们也揭示了Bre1并不直接影响INO80、SWR、RSC、Fun30等染色质重塑复合物募集到DNA双链断裂附近。综上所述,我们的实验结果暗示Bre1介导的H2B泛素化通过调控DNA断裂位点处的组蛋白动力学来促进同源重组。

论文目录

• 本论文的创新点
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
•   1 DNA双链断裂修复
•     1.1 机体内DNA双链断裂的来源
•     1.2 DNA双链断裂修复与癌症
•     1.3 DNA双链断裂修复途径
•       1.3.1 NHEJ修复
•       1.3.2 HR修复
•     1.4 DNA双链断裂修复中的组蛋白修饰与染色质重塑
•       1.4.1 DNA双链断裂修复中的组蛋白修饰
•       1.4.2 DNA双链断裂修复中的染色质重塑
•   2 Bre1 蛋白的研究进展
•     2.1 泛素化修饰过程与泛素化酶
•     2.2 Bre1 及其同源蛋白RNF20-RNF40 的结构
•     2.3 Bre1 及其同源蛋白RNF20-RNF40 与功能
•   3 本实验的目的和意义
• 第二章 Bre1 参与DNA双链断裂的同源重组修复
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 酵母菌株
•       2.1.2 质粒
•     2.2 常用培养基配制
•     2.3 酿酒酵母突变体构建
•       2.3.1 引物设计原理
•       2.3.2 酵母菌株外源DNA转化
•       2.3.3 酿酒酵母基因组粗提取
•       2.3.4 PCR与琼脂糖凝胶电泳
•     2.4 质粒重组体的构建
•     2.5 染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）
•     2.6 药物敏感性实验
•     2.7 异位同源重组修复实验
•     2.8 RNA-seq
•   3 实验结果
•     3.1 Bre1 促进DNA损伤修复
•     3.2 Bre1 促进了DNA双链断裂的同源重组修复途径
•     3.3 Bre1 不影响参与同源重组蛋白的转录
•     3.4 Bre1 蛋白被直接募集到DNA双链断裂的末端
•     3.5 Bre1 促进HR修复依赖于其对组蛋白H2B的泛素化
•   4 总结与讨论
• 第三章 Bre1 在同源重组起始末端剪切过程中的功能及机制研究
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 ChIP-qPCR
•     2.3 药物敏感性实验
•     2.4 异位同源重组修复实验
•     2.5 单链融合修复实验
•     2.6 Southern Blot
•   3 实验结果
•     3.1 Bre1 抑制HR修复的末端剪切加工过程
•     3.2 Bre1 抑制末端剪切加工过程的两条通路
•     3.3 Bre1 介导的H2B泛素化通过促进H3K79 甲基化来抑制末端剪切
•     3.4 Bre1 不是通过抑制末端剪切来调控HR修复
•   4 总结与讨论
• 第四章 Bre1 同源重组下游过程中的功能及机制研究
•   1 引言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•     2.2 ChIP-qPCR
•     2.3 药物敏感性实验
•     2.4 异位同源重组修复实验
•     2.5 酿酒酵母蛋白提取
•     2.6 Western Blot
•     2.7 染色质组分分离（Chromatin Fraction）
•   3 实验结果
•     3.1 Bre1-H2B泛素化影响RPA和 Rad51 装载到ssDNA上
•     3.2 Bre1-H2B泛素化促进断裂处组蛋白H3 的移除
•     3.3 bre1Δ菌株中过量表达Rad51 能够促进组蛋白H3 的移除
•     3.4 Bre1-H2B泛素化不影响染色质重塑复合物的募集
•     3.5 CAC1 敲除能够部分回复bre1Δ菌株的HR修复缺陷
•   4 总结与讨论
• 第五章 总结与讨论
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 附录三 博士期间已发表的科研论文
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 郑斯豪

导师: 陈学峰

关键词: 双链断裂,同源重组,泛素化,末端剪切

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q75

总页数: 104

文件大小: 3317K

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