偏肿革裥菌在木质环境下转录组分析与关键基因挖掘

论文摘要

木质素是一种复杂致密、非常稳定的网状结构物质,也是非常难降解的天然芳香族聚合物,是地球上继植物多糖纤维素后第二大丰富的生物可再生资源,木质素的降解不仅关乎到造纸等行业的发展,同时也影响着可再生性能源利用的发展。白腐菌因其特有的细胞外降解酶系,是迄今为止最有效、最主要的木质素降解微生物,可彻底降解木质素成为CO2和水,白腐菌对木质纤维基质的降解在自然界的碳素循环中起着关键作用,可为其他微生物类群提供大量易于吸收的植物多糖类物质,同时白腐菌对木质素的降解也是以绿色、无污染的方式进行。偏肿革裥菌（Lenzitesgibbosa）是我国东北林区常见的一种多孔菌科（Polyporaceae）白腐菌,生长在多种阔叶树的倒木、枯立木或活立木上,引起木材海绵状白色腐朽,也是一种生长速度较快、对木材和木质素分解能力较强的白腐菌,为了在分子层面上深入探索L.gibbosa降解木材和木质素的机理,本文利用HiSeq高通量测序技术对在木质和非木质条件下5个时间点的L.gibosa菌体样本进行了转录组测序,对差异表达的基因进行了功能注释与富集分析,对降解木质素的关键酶基因和关键通路进行了挖掘,并利用荧光定量PCR对重要的关键基因进行了表达量验证,主要研究结果如下:1、对在杨树木屑、水稻稻草、玉米秸秆3种不同木质纤维基质下的L.gibbo木质素降解酶系统进行了酶活检测,结果表明3种不同木质纤维基质均能使L.gibbosa的漆酶（laccase）和锰过氧化物酶（MnP）活性提高,其中木屑对2种酶活的促进作用最为明显,稻草次之、秸秆最差,这与3者成分中木质素含量排序一致（木质素含量杨树木屑最高、水稻稻草次之、秸秆最低）。在30d的检测时间内,木屑组的2种酶活始终保持增长,而秸秆组和稻草组的酶活在试验后期出现波动甚至降低。以上数据揭示了L.gibbosa降解不同类型木质基质时酶的活性变化规律,为后续结合转录组测序数据联合分析找到木质素降解酶关键基因奠定了基础。2、利用HiSeq高通量测序技术,对L.gibbosa在木质和非木质条件处理下的菌丝体进行了转录组测序与分析,从转录水平分析了L.gibbosa对木材与木质素降解的相关生物过程与代谢途径,结果表明 L.gibbosa对木材与木质素的分解代谢与氧化还原反应过程密切相关、与木质素分解等生物过程密切相关,与碳代谢、芳香化合物降解等通路密切相关。本研究得到一条与木质素降解有关的COG分类关键类目Q类（Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism）,一条木质素降解基因本体（Gene Ontology）关键类目（term）:G00046274（Lignin catabolic process）,一条木质素降解关键通路ko01220（Degradation of aromatic compounds）;通过表达量差异分析、差异表达基因的功能注释与分析,进一步得到一系列与木质素降解有关的关键酶及基因:NAD-P 结合结构域蛋白酶、NADP-dependent alcohol dehydrogenase 6（含 GroES2 域）、CYP450、Alcohol dehydrogenase（含 GroES1 域）、MnP2、MnP3、Versatile peroxidase VPL1（VP,MnP10s）、MrP1、Laccase D、Laccasel、LiP9、LiP2 等,为最终筛选L.gibbosa降解木质素的关键酶基因缩小了范围,为后续开展功能基因研究奠定了基础。3、结合转录组测序与酶活检测数据,进行加权基因共表达网络构建与分析,得到与漆酶和MnP相关的2个基因模块,即turquoise模块和blue模块。利用统计学方法得到 blue模块的82个关键基因（hub gene）,turquoise模块的261个hub genes,在这些hub genes中,利用COG、GO、KEGG注释分析,进一步缩小关键基因范围,结合转录组差异分析,确定了最终的11个关键基因:gene 14284、gene 11466、gene1 1537、gene 3902、gene 5357、gene6568、gene713、gene7760、gene 7855、gene 7857、gene 8611。4、对筛选到的11个L.gibbosa木质素降解关键酶基因进行qPCR检测,选择木屑、稻草、秸秆3种底物处理,结果表明木屑组的基因表达差异最为显著,秸秆与稻草组次之,这些基因在不同类型的纤维基质中都差异表达,表明它们都为L.gibbosa降解木质素的关键基因。5、通过RT-PCR技术克隆了 L gibbosa三条基因即mnpl0s（VP）、laccase D、cyp450,分析得到mnp10s（VP）基因CDS全长1089bp,编码362个氨基酸,含有“ligninase”保守结构域,属于plant peroxidase超家族蛋白;laccase D基因CDS全长1608bp,编码 535 个氨基酸,含有“CouRO 1 Tv-LCC like”和“CouRO 3 Tv-LCC like”两个保守结构域,属于Cupredoxin超家族蛋白;cyp450-up1基因CDS全长2001bp,编码666个氨基酸,属于P450超家族蛋白。以上研究为完整揭示偏肿革裥菌降解木材与木质素的机理奠定了重要的分子基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 引言
•   1.2 木质素的组成及生物降解
•     1.2.1 木质素的组成
•     1.2.2 木质素的生物降解
•   1.3 木材白腐菌
•     1.3.1 白腐菌的生物学背景
•     1.3.2 白腐菌应用与研究现状
•     1.3.3 偏肿革裥菌（Lenzites gibbosa）及其研究现状
•   1.4 白腐菌降解木质素酶系统
•     1.4.1 漆酶及其降解机制
•     1.4.2 LiPs及其降解机制
•     1.4.3 MnPs及其降解机制
•     1.4.4 其他木质素降解酶
•   1.5 高通量测序及生物信息学
•     1.5.1 转录组学
•     1.5.2 加权基因共表达网络分析
•   1.6 研究的目的与意义
• 2 偏肿革裥菌在不同木质纤维基质下木质素降解酶的活性规律
•   2.1 试验材料
•     2.1.1 供试菌种
•     2.1.2 供试木质纤维基质
•     2.1.3 主要试剂与仪器
•     2.1.4 培养基
•   2.2 试验方法
•     2.2.1 培养方法
•     2.2.2 MnP酶活测定方法
•     2.2.3 漆酶活性测定方法
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 三种木质纤维基质对MnP活性的影响
•     2.3.2 三种木质纤维基质对漆酶活性的影响
•   2.4 小结与讨论
• 3 木质和非木质条件下偏肿革裥菌转录组构建与分析
•   3.1 试验材料
•     3.1.1 供试菌株及木屑
•     3.1.2 主要试剂与仪器
•     3.1.3 培养基
•   3.2 试验方法
•     3.2.1 菌丝培养及处理
•     3.2.2 偏肿革裥菌总RNA提取及其质量鉴定
•     3.2.3 文库构建及上机测序
•     3.2.4 生物信息学分析
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 总RNA提取与质量检测
•     3.3.2 原始测序数据及其质量控制
•     3.3.3 转录组数据与参考基因组序列比对
•     3.3.4 转录组文库质量评估
•     3.3.5 SNP/InDel分析
•     3.3.6 可变剪接事件预测
•     3.3.7 基因结构优化分析
•     3.3.8 新基因分析
•     3.3.9 基因表达量分析
•     3.3.10 差异表达分析
•     3.3.11 差异表达基因功能注释和富集分析
•   3.4 小结与讨论
• 4 基因共表达网络和模块构建及核心基因筛选
•   4.1 数据来源
•   4.2 分析方法
•     4.2.1 检测离群样本及基因
•     4.2.2 WGCNA方法构建共表达网络
•     4.2.3 WGCNA模块的检测和识别
•     4.2.4 基因表达量与外部性状关联分析
•     4.2.5 目标模块中枢纽基因筛选
•     4.2.6 枢纽基因的富集分析
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 数据稳定性检测及关键参数确定
•     4.3.2 WGCNA网络构建和基因共表达模块聚类
•     4.3.3 WGCNA网络模块的关联度
•     4.3.4 与酶活数据联合分析与识别关键模块
•     4.3.5 hub genes的筛选
•   4.4 小结与讨论
• 5 偏肿革裥菌降解木质素关键基因表达特性分析
•   5.1 试验材料
•     5.1.1 供试菌种
•     5.1.2 供试木质纤维基质
•     5.1.3 主要试剂与仪器
•     5.1.4 培养基
•   5.2 试验方法
•     5.2.1 培养方法
•     5.2.2 总RNA提取及检测
•     5.2.3 反转录合成第一链cDNA
•     5.2.4 引物设计
•     5.2.5 荧光定量PCR检测
•   5.3 结果与分析
•     5.3.1 总RNA检测
•     5.3.2 qPCR扩增效率及引物特异性检测
•     5.3.3 木屑处理对11个木质素降解酶基因表达的影响
•     5.3.4 秸秆和稻草处理对11个木质素降解酶基因表达的影响
•   5.4 小结与讨论
• 6 偏肿革裥菌降解木质素关键基因的克隆与分析
•   6.1 试验材料
•     6.1.1 供试菌种
•     6.1.2 主要试剂与仪器
•   6.2 试验方法
•     6.2.1 菌丝获取
•     6.2.2 总RNA提取
•     6.2.3 第一链cDNA合成
•     6.2.4 目的基因CDS克隆
•     6.2.5 PCR产物胶回收
•     6.2.6 PCR产物连接、转化
•     6.2.7 菌落PCR鉴定
•     6.2.8 克隆基因的生物信息学分析
•   6.3 结果与分析
•     6.3.1 RNA质量检测
•     6.3.2 基因mnp10s（VP）, laccase D, cyp450的CDS克隆结果
•     6.3.3 mnp10s（VP）、laccase D、cyp450-up1基因分析
•   6.4 小结与讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 赵清泉

导师: 池玉杰,马玲

关键词: 白腐菌,偏肿革裥菌,木质素,降解,转录组,加权基因共表达

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东北林业大学

分类号: Q78

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000099

总页数: 189

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