基于新材料和新策略的洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶固定化及其应用研究

论文摘要

高性能的脂肪酶在能源工业、医药工业、精细化学品合成和食品工业中具有广泛的应用。固定化技术可以有效解决游离酶的很多缺陷。传统的固定化通常是在单种载体上使用单一固定化策略;同时大部分有载体的固定化酶中目标蛋白的含量极低;且将固定化策略与载体形态结构结合在一起的研究报道也较少。为解决上述问题,本研究在对洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶分子进行充分的分子结构分析的基础上,研究了离子交换和共价键合协同作用的固定化策略;将三聚氰胺-戊二醛超支化合物连接在磁性纳米颗粒表面,极大地提高了目标蛋白的载量;将氧化碳纳米管插入磷酸盐纳米花的核心中,获得了结构得到增强的复合材料。将上述得到的固定化酶进行了实际应用研究,验证了其良好催化性能。主要研究内容及结果摘要如下:1.以洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶为研究对象,对其进行生物信息学分析,根据BCL分子表面活性氨基酸的分布,结合固定化载体的特征,以提高载体上酶分子活性和载体上蛋白质载量为目的,设计了三种固定化酶,分别为离子交换和共价键合联合运用的BCL-GEAMNP、修饰了三聚氰胺-戊二醛树状分子的定向固定化酶BCL-GTAMNP和氧化碳纳米管增强的磷酸盐-BCL复合纳米花。2.以BCL-GEAMNP为研究对象,首先采用各种表征手段测定载体和固定化酶BCL-GEAMNP的各种性质,以确定载体合成和固定化的成功;之后对固定化条件进行优化,在最佳条件下,固定化酶的转酯酶活回收率为147.4%;所得的固定化酶BCL-GEAMNP用于合成生物柴油,以叔丁醇作为最佳反应介质;对反应条件进行优化后,在最适反应条件下,生物柴油得率在9 h时达到90.2%,12 h达到96.8%;可重复性实验表明BCL-GEAMNP的操作稳定性和催化转酯反应的效率优于仅利用共价键合法合成的固定化酶BCL-GAMNP。3.通过各种表征手段研究各种固定化载体和固定化酶的性质,确定采用一步法合成的载体GTAMNP具有蛋白载量高和合成简便的优势,同时载体合成,修饰和固定化的成功也得到确认;之后在经优化后的最佳的固定化条件下,固定化酶的酯化比酶活和酶活回收率分别为76675.6 U/g-protein和5815.1%;在最适固定化条件下合成的BCL-GTAMNP用于催化1-苯乙醇和乙酸乙烯酯的转酯反应,经反应条件的单因素优化和反应介质的筛选后,转酯反应的转化率和ees值分别可达到45.8%和84.3%;而经底物乙酸乙烯酯处理过的固定化酶BCL-GTAMNP,其催化的拆分反应的ees值在20 min就能达到98.8%。4.以七种复合纳米材料为研究对象,经FSEM和FT-IR表征确定材料合成和固定化的成功;经固定化后,所有添加了碳纳米管的固定化酶酶活较高,这说明在固定化时采用吸附法得到的固定化酶活效果明显优于只采用结晶沉淀法制备的固定化酶,经氧化碳纳米管增强后,各固定化酶的酯化酶活得到提升。将所有的固定化酶用于拆分1-苯乙醇,反应的ees值提高明显。选择拆分效果较好的四种固定化酶作为研究对象,经优化后,效果最好的Cu3（PO4）2/CNT/BCL催化的反应转化率和ees值分别为49.6%和98.3%,且它们的可重用性均较好,说明盐结晶沉淀和物理吸附结合的方法制备的固定化酶在非水相催化反应中具有巨大优势。5.为进一步对比不同的固定化酶在非水相催化反应中的优劣,将四种固定化酶BCL-GAMNP、BCL-GEAMNP、BCL-GTAMNP和Cu3（PO4）2/CNT/BCL用于有机相中制备香料添加剂乙酸龙葵酯。经比较后发现,它们的酯化酶活分别较游离酶的提升明显;经反应条件优化,其中BCL-GTAMNP催化反应的转化率可以在20 min内达到99.9%;Cu3（PO4）2/CNT/BCL的可以在10 min内达到99.2%;对固定化酶进行可重用性实验,反应重复8个批次后,转化率几乎未发生改变,BCL-GTAMNP和Cu3（PO4）2/CNT/BCL的效果最佳。说明固定化脂肪酶也可用于乙酸龙葵酯的合成,且相对化学法具有一定的优势。综上,本研究在对脂肪酶分子进行充分分子结构分析的基础上,利用三种新的固定化策略,分别得到三种新式固定化脂肪酶,它们结构稳定、酶活高、耐受性好,且分别在合成生物柴油、拆分手性底物和合成乙酸龙葵酯方面取得了良好的效果,具有很大的工业应用潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 脂肪酶的简介
•   1.2 脂肪酶的应用
•   1.3 脂肪酶性能增强的方法
•   1.4 脂肪酶的固定化
•   1.5 研究背景和意义
• 2 洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的生物信息学分析及固定化方法选择
•   2.1 材料与方法
•   2.2 结果与分析
•   2.3 讨论与小结
• 3 双功能磁性纳米颗粒GEAMNP固定化BCL及固定化酶在生物柴油制备中的应用
•   3.1 材料与方法
•   3.2 结果与分析
•   3.3 讨论与小结
• 4 三聚氰胺-戊二醛树状分子修饰的磁性纳米颗粒GTAMNP固定化BCL及固定化酶拆分1-苯乙醇的研究
•   4.1 材料与方法
•   4.2 结果与分析
•   4.3 讨论与小结
• 5 三种碳纳米管-磷酸盐纳米花固定化BCL及固定化酶拆分1-苯乙醇的研究
•   5.1 材料与方法
•   5.2 结果与分析
•   5.3 讨论与小结
• 6 四种固定化酶在乙酸龙葵酯合成中的应用研究
•   6.1 材料与方法
•   6.2 结果与分析
•   6.3 讨论与小结
• 7 全文总结和展望
•   7.1 全文总结
•   7.2 创新点
•   7.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 设备与仪器
• 附录2 主要缩写词
• 附录3 攻读博士期间发表的文章

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李凯

导师: 闫云君

关键词: 脂肪酶,固定化,磁性纳米颗粒,三聚氰胺,戊二醛,纳米碳管,纳米花,生物柴油,手性拆分,苯乙醇,乙酸龙葵酯

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华中科技大学

基金: 国家863计划重大项目课题“聚氨酯类产品的生物-化学组合合成技术”(2011AA02A204),自然科学基金“高效拆分2-芳基丙酸类手性药物的皱褶假丝酵母嵌合脂肪酶的研究”(No.31170078)

分类号: Q814.2

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.004857

总页数: 196

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