（湖南省肿瘤医院湖南长沙410013）
摘要：目的探讨MMP-9基因多态性与鼻咽癌无远处转移生存（distantmetastasis-freesurvival，DMFS）的关系。方法本研究总共入组183例局部区域晚期鼻咽癌患者。选择MMP-9rs3918242、rs2250889和rs17576共3个潜在功能性多态性位点。基因分型采用聚合酶链接反应-连接酶检测反应（PCR-LDR）方法。本研究的主要研究终点为DMFS。Cox比例风险模型分析基因型与DMFS的相关性。结果单因素分析发现MMP-9rs2250889（P=0.018）和rs17576（P=0.002）多态性与患者DMFS相关，校正混杂因素后仅rs17576多态性（GGvs.GA/AA，HR=2.025，95%CI：1.075-3.816，P=0.029）为患者DMFS的独立预后因素。结论MMP-9rs17576可能是局部区域晚期鼻咽癌DMFS新的预后指标。
关键词：基质金属蛋白酶；基因多态性；鼻咽癌；无远处转移生存
Matrixmetalloproteinase-9genepolymorphismsanddistantmetastasis-freesurvivaloflocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma
LIUHuai，LIYanxian，LIYu，GUOGeyang，LIYu，HUYing，LUOYing*
（HunanCancerHospital，Changsha，410013，China）
Abstract：Purpose：Toexploretheassociationbetweensinglenucleotidepolymorphisms（SNP）ofmatrixmetalloproteinase-9（MMP-9）geneanddistantmetastasis-freesurvival（DMFS）oflocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma（NPC）.Method：Onehundredandeighty-threepatientswereincludedinthisstudy.ThreeSNPsofMMP-9wereselected，includingrs3918242，rs2250889andrs17576.Polymerasechainreaction-ligasedetectionreaction（PCR-LDR）methodwasusedforgenotyping.TheprimaryendpointofthisstudywasDMFS.TheassociationbetweenSNPsandDMFSwastestedbyCoxproportionalhazardmodel.Results：UnivariateanalysisshowedthatMMP-9rs2250889（P=0.018）andrs17576（P=0.002）genotypeswererelatedwithDMFS.However，rs17576genotypes（GGvs.GA/AA，HR=2.025，95%CI：1.075-3.816，P=0.029）wasstillsignificantlyassociatedwithDMFSafteradjustingconfoundingfactors.Conclusion：MMP-9rs17576maybeanovelprognosticgeneticmarkerforDMFSinpatientswithlocoregionallyadvancedNPC.
Keywords：Matrixmetalloproteinase；Singlenucleotidepolymorphism；Nasopharyngealcarcinoma；Distantmetastasis-freesurvival
1.前言
鼻咽癌具有明显的地域分布差异，中国是鼻咽癌的高发区，尤其在华南地区，鼻咽癌的年龄标准化的发病率可高达30/10万[1]。鼻咽癌对放射治疗和化疗均高度敏感，随着磁共振成像技术、调强放疗（intensity-modulatedradiotherapy，IMRT）和放化综合治疗的广泛应用，鼻咽癌的生存率获得显著提高。研究显示早期鼻咽癌患者（Ⅰ-Ⅱ期）5年总生存率（overallsurvival，OS）超过90%[2，3]，而局部区域晚期患者（Ⅲ-Ⅳa-b）的OS也可高达70%[4]。但是，仍有20-30%的患者治疗后发生远处转移，成为鼻咽癌治疗失败最主要的原因[5]。而转移鼻咽癌治疗效果差，中位生存时间仅约20余月[6]，成为制约鼻咽癌疗效进一步提高的关键因素。因此，现阶段亟需寻求鼻咽癌远处转移相关的预后指标。
基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是一类Zn2+依赖的内肽酶家族，能够水解细胞外基质的所有组分[7]，因而其在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥了重要的作用。近年来，越来越多研究证实MMP可通过调节细胞黏附和迁徙、介导内皮-间充质转化、调节细胞因子和生长因子的释放及其与受体之间的相互作用、调控肿瘤新生血管生成等机制参与肿瘤的发生和发展[8]。其中MMP-9是MMP家族中重要的一员，它是基底膜的重要组成部分[9]，同时也在多种实体肿瘤中高表达，并能明显提高肿瘤的侵袭和转移能力[10]。多项研究证实肿瘤组织和体液中过表达的MMP-9与患者不良预后明显相关[11]。
单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。MMP-9基因的功能性SNP可能通过影响MMP-9蛋白的表达和结构从而导致肿瘤增殖、侵袭和转移等生物学行为的改变[12]。笔者前期一项研究发现MMP-9rs17576基因多态性可作为局部区域晚期鼻咽癌新的预后指标，然而MMP-9基因多态性与鼻咽癌远处转移的关系目前仍不明确，有待进一步研究。因此，本研究将探讨MMP-9基因多态性与局部区域晚期鼻咽癌无远处转移生存的相关性，以期寻找新的预后遗传指标。
2.材料与方法
2.1患者入选标准
研究选择2010年07月至2011年8月期间在湖南省肿瘤医院住院治疗的患者。入选标准如下：①初治鼻咽癌病理诊断明确（WHO病理分型Ⅱ-Ⅲ型），②临床分期为Ⅲ-Ⅳa-b期（AJCC/UICC第七版分期），③年龄18-65岁的汉族人，④ECOG一般状况评分0-1分，⑤接受根治性放疗联合化疗。本研究排除合并远处转移或严重心肺肾等严重疾病的患者。研究最终收集183例局部区域晚期鼻咽癌患者，患者临床特征见表-1。
2.2患者治疗情况
患者均接受根治性放疗，采用6-8MV光子线照射，其中112例（61.2%）患者采用常规放疗，剩余71例（38.8%）患者接受IMRT。常规放疗技术参考研究团队成员前期发表的文献[13]，IMRT靶区勾画及处方剂量参考RTOG0225[14]和RTOG0615[15]。鼻咽部处方剂量70-74Gy，阳性淋巴结68-70Gy，颈部预防照射剂量50Gy。
所有患者均接受铂类药物为基础的双药诱导化疗加同时期化疗，其中132例（72.1%）患者接受辅助化疗。化疗方案采用顺铂或奈达铂80mg/m2d1，氟尿嘧啶500mg/m2d1-5。
2.3治疗期间评价及随访
治疗期间根据临床体检、间接鼻咽镜、鼻咽部+颈部MRI等评价疗效。患者治疗结束后前三年每三个月复查一次，随后每半年复查一次，随访检查包括全面体格检查、头颈部肿瘤专科检查、鼻咽和颈部MRI、鼻咽纤维镜、腹部B超、胸片，必要时接受ECT、CT或PET/CT检查。所有患者中位随访时间为56.0个月。
2.4SNPs位点选择及基因分型
SNP位点的选择主要基于既往已经发表的文献和美国国家生物技术信息中心SNP数据库（NCBI，dbSNP）。入选的SNP位点须为潜在功能性的多态性位点，且在亚洲人群中最小等位基因频率大于或等于0.05。本研究最终选择3个MMP-9多态性位点，包括：rs3918242、rs2250889和rs17576。
所有患者留取血标本，抽提全基因组DNA。基因型检测采用聚合酶链反应-连接酶检测反应（polymerasechainreaction-ligasedetectionreaction，PCR-LDR）技术。
2.6统计分析
本研究主要研究终点为无远处转移生存率（distantmetastasis-freesurvival，DMFS），定义为从患者确诊之日起到患者发生远处转移或末次随访日期。Hardy-Weinberg遗传平衡定律采用χ2检验进行检测。生存曲线采用Kaplan-Meier方法模拟，Log-Rank检验比较生存曲线之间的差异。Cox比例风险模型分析基因型与患者DMFS的相关性，并估计风险比（hazardratio，HR）和95%置信区间（confidenceinterval，CI）。校正的协变量包括：年龄（≤45岁vs.>45岁）、性别（男vs.女）、病理类型（WHOⅡ型vs.Ⅲ型）、T分期（T1-2vs.T3-4）、N分期（N0-1vs.N2-3）。采用SPSS22.0程序包（SPSS，Chicago，IL，USA）进行以上统计分析。以P<0.05表示差异有统计学意义，均采用双侧检验标准。
3.结果
3.1各SNP位点基因型分布
183例送检样本中，3个SNP位点分别有2例标本未能分型，分型成功率为98.9%。所有位点基因型分布见表-2。3个SNP位点经过Hardy-Weinberg检验，均处于平衡状态（P>0.05）。
*采用χ2检验检测SNP位点Hardy-Weinberg遗传平衡
3.2患者治疗结局
46例（25.1%）患者在随访期内发生远处转移，所有患者3年、5年DMFS分别为80.2%和73.3%。41例患者死亡，所有患者3年、5年总生存率分别为85.0%和74.1%。
*校正的协变量包括：年龄（≤45岁vs.>45岁）、性别（男vs.女）、病理类型（WHOⅡ型vs.Ⅲ型）、T分期（T1-2vs.T3-4）、N分期（N0-1vs.N2-3）。
3.3MMP-9基因多态性与局部区域晚期鼻咽癌患者DMFS的关系
表-3单因素分析显示MMP-9rs3918242与局部区域晚期鼻咽癌患者DMFS无明显相关。而MMP-9rs2250889和rs17576与患者DMFS相关，其中rs2250889CG/GG基因型发生远处转移的风险是CC野生型的约2倍（P=0.018），rs17576GA/AA基因型发生远处转移的风险是GG野生型的约2.5倍（P=0.002）。然而校正年龄、性别、病例类型、T分期、N分期后，仅MMP-9rs17576基因多态性与患者DMFS明显相关，其中GA/AA基因型发生远处转移的风险明显增高（GGvs.GA/AA，HR=2.025，95%CI：1.075-3.816，P=0.029）。
Kaplan-Meier法计算结果显示携带MMP-9rs2250889CC和CG/GG基因型的患者3年、5年DMFS率分别为84.0%、80.0%和74.0%、61.9%（P=0.016，图1a）。患者携带MMP-9rs17576GG和GA/AA基因型的3年、5年DMFS率分别为84.7%、82.6%和73.9%、59.4%（P=0.002，图1b）。
图1-b携带MMP-9rs17576不同基因型的患者无远处转移生存曲线
4.讨论
本研究探讨MMP-9基因多态性与局部区域晚期鼻咽癌患者DMFS的关联，结果发现MMP-9rs17576多态性与患者DMFS明显相关，可能作为局部区域晚期鼻咽癌DMFS新的预后遗传标志。
虽然我们没有进行进一步的机制研究，但是结合MMP-9的功能和既往发表的文献，我们认为研究结果有据可依。首先，国内学者发现肿瘤组织中过表达MMP-9是鼻咽癌患者不良预后因素[16]，提示MMP-9在鼻咽癌的发展中可能发挥了关键作用。其次，既往研究结果证明MMP-9rs17576多态性是具有重要功能的多态性位点，它可能影响MMP-9的结构和功能。
rs17576位于MMP-9第6号外显子区，该区域翻译出来的蛋白质是MMP-9催化区的组成部分，因此该位点的多态性可能影响MMP-9与底物弹性蛋白的结合[17]。来自日本[18]和中国[19]的学者分别报道rs17576多态性与肾细胞癌和非小细胞肺癌患者的生存密切相关。我们研究也发现携带279A等位基因（GA/AA）的鼻咽癌患者DMFS均较GG基因型患者明显下降，且多因素分析显示该位点的多态性是患者DMFS的独立预后因素。rs17576位点由279G变异为279A导致氨基酸由带正电荷的精氨酸转变为不带电的谷氨酰胺，Hu等认为正是因为这种氨基酸的改变可能影响了MMP-9蛋白的功能[19]。但是其具体的生物学机制仍待进一步深入研究。
然而本研究仍存在以下局限，首先，本研究是一项回顾性研究，其次，研究的样本量较小，同时缺乏独立人群的验证，因此，本研究结果仍有待多中心、大样本的进一步验证。综上所述，本研究发现MMP-9rs17576多态性可能是局部区域鼻咽癌患者DMFS的独立预后因子，治疗前对患者MMP-9rs17576多态性进行基因分型可能帮助我们更精确的判断患者转移风险，并指导个体化治疗。
参考文献
[1]LeeAW，MaBB，NgWT，etal.ManagementofNasopharyngealCarcinoma：CurrentPracticeandFuturePerspective[J].JClinOncol，2015，33（29）：3356-3364.
[2]ChenQY，WenYF，GuoL，etal.ConcurrentchemoradiotherapyvsradiotherapyaloneinstageIInasopharyngealcarcinoma：phaseIIIrandomizedtrial[J].JNatlCancerInst，2011，103（23）：1761-1770.
[3]SuSF，HanF，ZhaoC，etal.Long-termoutcomesofearly-stagenasopharyngealcarcinomapatientstreatedwithintensity-modulatedradiotherapyalone[J].IntJRadiatOncolBiolPhys，2012，82（1）：327-333.
[4]XiaoWW，HuangSM，HanF，etal.Localcontrol，survival，andlatetoxicitiesoflocallyadvancednasopharyngealcarcinomatreatedbysimultaneousmodulatedacceleratedradiotherapycombinedwithcisplatinconcurrentchemotherapy：long-termresultsofaphase2study[J].Cancer，2011，117（9）：1874-1883.
[5]ChanOS，NganRK.InpidualizedtreatmentinstageIVCnasopharyngealcarcinoma[J].OralOncol，2014，50（9）：791-797.
[6]ZhangL，HuangY，HongS，etal.Gemcitabinepluscisplatinversusfluorouracilpluscisplatininrecurrentormetastaticnasopharyngealcarcinoma：amulticentre，randomised，open-label，phase3trial[J].Lancet，2016，388（10054）：1883-1892.
[7]ChambersAF，MatrisianLM.Changingviewsoftheroleofmatrixmetalloproteinasesinmetastasis[J].JNatlCancerInst，1997，89（17）：1260-1270.
[8]RoyR，YangJ，MosesMA.Matrixmetalloproteinasesasnovelbiomarkersandpotentialtherapeutictargetsinhumancancer[J].JClinOncol，2009，27（31）：5287-5297.
[9]WilsonCL，MatrisianLM.Matrilysin：anepithelialmatrixmetalloproteinasewithpotentiallynovelfunctions[J].IntJBiochemCellBiol，1996，28（2）：123-136.
[10]JordanRC，Macabeo-OngM，ShiboskiCH，etal.Overexpressionofmatrixmetalloproteinase-1and-9mRNAisassociatedwithprogressionoforaldysplasiatocancer[J].ClinCancerRes，2004，10（19）：6460-6465.
[11]PellikainenJM，RopponenKM，KatajaVV，etal.Expressionofmatrixmetalloproteinase（MMP）-2andMMP-9inbreastcancerwithaspecialreferencetoactivatorprotein-2，HER2，andprognosis[J].ClinCancerRes，2004，10（22）：7621-7628.
[12]JinG，MiaoR，HuZ，etal.PutativefunctionalpolymorphismsofMMP9predictsurvivalofNSCLCinaChinesepopulation[J].IntJCancer，2009，124（9）：2172-2178.
[13]罗英，席许平，廖遇平.常规分割与后程三维适形放射治疗鼻咽癌的对比观察[J].实用癌症杂志，2003（05）：536-538.
[14]LeeN，HarrisJ，GardenAS，etal.Intensity-modulatedradiationtherapywithorwithoutchemotherapyfornasopharyngealcarcinoma：radiationtherapyoncologygroupphaseIItrial0225[J].JClinOncol，2009，27（22）：3684-3690.
[15]LeeNY，ZhangQ，PfisterDG，etal.Additionofbevacizumabtostandardchemoradiationforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma（RTOG0615）：aphase2multi-institutionaltrial[J].LancetOncol，2012，13（2）：172-180.
[16]LiuZ，LiL，YangZ，etal.IncreasedexpressionofMMP9iscorrelatedwithpoorprognosisofnasopharyngealcarcinoma[J].BMCCancer，2010，10：270.
[17]ZhangB，HenneyA，ErikssonP，etal.Geneticvariationatthematrixmetalloproteinase-9locusonchromosome20q12.2-13.1[J].HumGenet，1999，105（5）：418-423.
[18]AwakuraY，ItoN，NakamuraE，etal.Matrixmetalloproteinase-9polymorphismsandrenalcellcarcinomainaJapanesepopulation[J].CancerLett，2006，241（1）：59-63.
[19]JinG，MiaoR，HuZ，etal.PutativefunctionalpolymorphismsofMMP9predictsurvivalofNSCLCinaChinesepopulation[J].IntJCancer，2009，124（9）：2172-2178.
作者简介：刘怀，男，博士研究生，研究方向：恶性肿瘤放射治疗的临床及转化研究
*通讯作者：罗英，女，本科生，主任医师，研究方向：恶性肿瘤放射治疗的临床研究.
基金资助：湖南省卫生计生委基金（B2016053）