论文摘要
人类基因组约70-90%的位点都可以进行转录,但只有少于2%的基因组位点可以编码蛋白质,所以非编码RNA(non-coding RNAs,ncRNAs)占据了大部分转录组。近几十年,大量文献揭示了ncRNAs的存在以及其在基因表达调控中的作用。长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)为ncRNAs的一类,可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ceRNAs)吸附微小RNA(microRNAs,miRNAs),从而调控基因的表达。然而,在不同的细胞环境下,ceRNAs在多大程度上对基因表达起到调控作用以及其会产生怎样的调控结果目前还不明确。所以,在本实验中,我们将在体细胞重编程过程中探究ceRNAs的调控作用。外源表达多能性相关转录因子可以使细胞命运发生转变,完成重编程。2006年,Yamanaka等人利用慢病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM)四种转录因子转入小鼠胎儿成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中,成功诱导出了多能性干细胞,并将其命名为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。在本研究中,我们利用强力霉素(doxycycline,dox)介导的Yamanaka四因子对MEFs进行诱导,并将收集的MEFs、重编程第3天的细胞(day 3 reprogramming MEFs,dya 3rMEFs)、重编程第6天的细胞(day 6 reprogramming MEFs,day 6 rMEFs)和完全重编程的iPSCs分别进行去核糖体RNA高通量测序(ribo-minus RNA-seq)和小RNA高通量测序(small RNA-seq)。首先,通过生物信息学分析,我们发现:在重编程的过程中,MEFs来源的miRNAs在重编程过程中的细胞中都保持较高的表达水平,但在完全重编程的iPSCs中表达量明显减少。然而很多被这些miRNAs靶定的基因在重编程过程中表达水平显著升高,包括Oct4、Klf4、Nanog、Tbx3、Sall4和Esrrb等多能性相关因子。同时,与这些miRNAs有互补结合位点的长链基因间非编码RNA(long intergenic noncoding RNAs,lincRNAs)和环状RNA(circular RNAs,circRNAs)也在重编程过程中呈现高表达水平。所以我们猜想,lincRNAs和circRNAs可能作为ceRNAs吸附miRNAs从而阻碍了miRNAs在重编程过程中的活性。接下来,为了验证这个假设,我们在重编程过程中检测了ceRNAs对外源Oct4表达的调控作用。我们首先确定在细胞重编程过程中过表达mmu-miR-21a-3p,mmu-miR-421-3p,mmu-miR-497a-5p和mmu-miR-532-3p可抑制外源Oct4的表达,之后在MEFs中敲低与Oct4含有相同miRNAs结合位点的lincRNAs和circRNAs,并检测Oct4的表达水平、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)阳性克隆形成率以及嵌合体形成效率,结果发现,lincRNA ENSMUSG00000092341和circRNAs mmucirc00006895、mmucirc00000319敲低引起外源Oct4的表达量下调、重编程效率降低以及iPSCs嵌合能力减弱。通过上述研究,我们得出结论:(1)成纤维细胞来源的miRNAs在重编程过程中维持较高表达水平,在iPSCs中表达量显著下降;(2)在细胞重编程过程中,lincRNA ENSMUSG00000092341、circRNAs mmucirc00006895和mmucirc00000319作为ceRNAs吸附靶定Oct4的miRNAs并对外源Oct4的表达有调控作用;(3)lincRNA ENSMUSG00000092341和circRNAs mmucirc00006895、mmucirc00000319对iPSCs克隆的形成及iPSCs的质量有维持作用;(4)lincRNAs和circRNAs可作为ceRNA调控体细胞重编程。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 张晓蕾
导师: 孔庆然
关键词: 微小,长链基因间非编码,环状,竞争性内源,重编程
来源: 东北农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 东北农业大学
基金: 国家自然基金(C2018032)
分类号: Q75
总页数: 56
文件大小: 4558K
下载量: 105
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标签:微小论文; 长链基因间非编码论文; 环状论文; 竞争性内源论文; 重编程论文;