干扰Hi-Lnc70和miR-375对人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

论文摘要

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）来源于囊胚内细胞团,可以长期维持自我更新,并具有分化形成各种组织细胞的潜能。hESCs在特定条件下可分化为胰岛素分泌细胞（insulin-producing cells,IPCs）,用于移植治疗Ⅰ型糖尿病,解决临床治疗器官来源不足的问题。MiR-375是胰腺发育和成熟过程中必不可少的转录调控因子,在胰岛β细胞和非β细胞中均有表达,能够提高胰岛素转录水平,促进胰岛β细胞增殖。Hi-Lnc70是在胰岛β细胞发育过程中特异性高表达的lncRNA,影响β细胞形成和生理功能。因此,研究miR-375和Hi-Lnc70在hESCs向IPCs分化过程中的作用,对于提高hESCs向IPCs分化的效率,获得单一表达Insulin的成熟胰岛β细胞具有重要意义。本实验所使用的hESCs向IPCs分化方案包括定形内胚层（Stage I）、原肠（Stage II）、内分泌前体（Stage III）和胰腺内分泌细胞（Stage IV）四个阶段。通过在分化的不同阶段对胰腺发育相关基因和Hi-Lnc70和miR-375的检测,发现在向定形内胚层分化阶段的培养液中添加25 ng/mL wnt3a的方案,能维持细胞良好的生长状态,同时高表达胰腺发育成熟相关基因。同时根据已经发表的人Hi-Lnc70的抑制序列,构建Hi-Lnc70的RNA干扰载体。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的Hi-Lnc70抑制质粒转染,发现瞬时抑制Hi-Lnc70可提高Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表达水平,促进PDX1蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的合成。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 mimic转染,发现瞬时过表达miR-375,可提高Pdx1、Insulin表达水平并促进PDX1蛋白和胰岛素合成,同时降低Glucagon和Somatostatin表达水平,减少胰高血糖素和生长激素抑制素的合成,进而降低细胞多激素共表达程度。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 inhibitoror转染,发现瞬时抑制miR-375,可降低Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表达水平,减少PDX1蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的合成。本研究证明在hESCs向IPCs分化过程中抑制Hi-Lnc70和过表达miR-375可提高胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平。提高分化过程中细胞miR-375水平可以降低分化末期细胞多激素共表达程度,促进β细胞成熟和胰岛素合成。抑制miR-375则降低胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平,为深入研究非编码RNA在胰岛发育中的作用提供了新的思路。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一部分 文献综述 LncRNA和 miRNA的研究进展
•   前言
•   1 LncRNA
•     1.1 LncRNA的分类
•     1.2 LncRNA的功能
•     1.3 胰岛β细胞中的lncRNA
•     1.4 hESC分化中的lncRNA
•   2 MicroRNA
•     2.1 MicroRNA的发生和加工
•     2.2 MicroRNA的运输
•     2.3 胰岛细胞中的microRNA
•     2.4 ESC胰向分化中的microRNA
•   3 展望
• 第二部分 实验研究 干扰Hi-Lnc70和miR-375 对人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响
•   前言
•   1 试剂和设备
•     1.1 试剂和材料
•     1.2 仪器和设备
•   2 方法
•     2.1 hESCs向 IPCs分化培养方案
•     2.2 Hi-Lnc70 抑制质粒的构建
•       2.2.1 目的基因片段的获取及酶切
•       2.2.2 目的基因连入基础载体
•       2.2.3 干扰质粒重组子的验证
•     2.3 脂质体介导的Hi-Lnc70 抑制质粒瞬时转染
•     2.4 脂质体介导的miR-375 mimic和 miR-375 inhibitor瞬时转染
•     2.5 鉴定分化各阶段细胞
•       2.5.1 提取总RNA
•       2.5.2 反转录
•       2.5.3 实时荧光定量PCR
•       2.5.4 统计学分析
•       2.5.5 免疫荧光染色
•       2.5.6 Western blot检测
•   3 结果
•     3.1 在StageI添加不同浓度Wnt3a对分化的影响
•       3.1.1 不同浓度Wnt3a对 hESCs向胰岛β细胞分化形态的影响
•       3.1.2 不同浓度Wnt3a对人胚胎干细胞定向分化为胰岛β细胞的影响
•       3.1.3 不同浓度Wnt3a对人胚胎干细胞分化过程中miR-375 表达水平的影响
•       3.1.4 不同浓度Wnt3a对人胚胎干细胞分化过程中Hi-Lnc70 表达水平的影响
•     3.2 干扰Hi-Lnc70 对分化的影响
•       3.2.1 Hi-Lnc70 抑制质粒构建结果
•     3.2.1.1 目的质粒双酶切
•     3.2.1.2 重组质粒的鉴定
•       3.2.2 Hi-Lnc70 干扰后hESCs分化培养过程中细胞形态
•       3.2.3 Hi-Lnc70 干扰后实时荧光定量PCR
•       3.2.4 Hi-Lnc70 干扰后免疫荧光染色
•       3.2.5 Hi-Lnc70 干扰后western blot检测分化细胞中PDX1 和胰岛素
•     3.3 干扰miR-375 对分化的影响
•       3.3.1 miR-375 干扰后hESCs分化培养过程中细胞形态
•       3.3.2 miR-375 干扰后实时荧光定量PCR
•       3.3.3 miR-375 干扰后免疫荧光染色
•       3.3.4 miR-375 干扰后western blot检测分化细胞中PDX1 和胰岛素
•   4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王旭

导师: 李雪玲

关键词: 人胚胎干细胞,胰岛素分泌细胞

来源: 内蒙古大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 内蒙古大学

基金: 国家自然科学基金(No.81471001),国家转基因重大专项(2016ZX08010001-002和2016ZX08010005-001)

分类号: R329.2

总页数: 70

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