彭江涛（长沙医学院湖南长沙410219）
摘要：目的应用氨茶碱治疗宫内窘迫的新生鼠，观测其对肺组织的影响。方法建立宫窘模型后，在腹腔给母鼠腹腔注射氨茶碱注射液进行治疗，然后对新生大鼠的体重、肺系数、肺泡数以及SP-A的表达进行分析。结果实验组C组和D组与对照组比较，肺系数明显升高，有统计学意义（P<0．01）。实验组C组和D组与对照组比较，肺泡数量明显增多，肺泡腔基本正常，肺泡间隔无增厚或变薄，有统计学意义（P<0．05）。实验组肺SP-AmRNA表达明显，各组间差异无显著性（P>0．05）。结论宫内窘迫胎鼠运用氨茶碱注射液治疗具有一定可行性，宫窘的大鼠越早应用氨茶碱疗效越好，新生大鼠肺组织功能性越强。
关键词：窘迫胎鼠；氨茶碱；肺组织改变
胎儿窘迫是导致胎儿窒息死亡的主要原因，占围产儿死亡原因的首位。窘迫发生时，肺泡Ⅱ型上皮细胞体积缩小、染色体聚集等典型的细胞凋亡变化，肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可导致肺泡表面活性物质（pulmonarysurfactant，PS）减少，造成局部肺泡塌陷和肺不张；血管内皮细胞的大量凋亡导致肺微血管壁完整性受损通透性增加，引发和促进肺水肿和肺换气功能障碍。临床上主要应用静脉注射三联药物进行治疗窘迫：即50％葡萄糖60ml加维生素C500mg及尼可刹米0.375g静脉注射主要直接兴奋延髓呼吸中枢。氨茶碱是细胞磷酸二酯酶抑制剂，能使子宫胎盘血流量增加20%-40%，降低宫腔压力，从而缓解宫缩过强，脐带因素引起的缺氧状态。还可提高母体间氨基酸的转运能力，增加胎鼠肝和胎盘的环磷酸腺苷（cAMP）含量，可导致肺表面活性物质产生，有助于增强胎鼠对缺氧的耐受性。本文主要对氨茶碱应用于宫内窘迫胎鼠时其肺组织的组织形态学改变进行阐述，为进一步研究氨茶碱治疗宫内窘迫的作用机理提供线索。
1、材料与方法
1.1材料
（1）药品：氨茶碱注射液2ml/0.25g共40支；生理盐水；由长沙医学院第一附属医院提供。实验器材及实验室由长沙医学院病理生理教研室提供。
（2）动物：16周龄健康成年大鼠60只，雌雄各半，重约250-280g，发情期将雌鼠与雄鼠1：1合笼过夜，次日晨观察到阴栓定为妊娠第1天，于妊娠第17天进行实验。大鼠由长沙市动物实验中心提供。
1.2模型建立及动物实验分组
本实验采用阻断孕17天大鼠双侧子宫动脉后恢复血供建立宫内窘迫动物模型：以戊巴比妥钠经腹腔注射麻醉，修剪术鼠毛，安尔碘消毒后，取下腹部正中切口长约3-4cm进腹，暴露双侧动静脉，在子宫血管襻两端连同周围结缔组织一同钳夹，阻断血流，15min分钟后取出血管夹复流，关腹。宫窘成功的判断：运用apgar观察新生大鼠的肤色，肌张力，心率，对刺激的反应和呼吸程度来判断实验宫窘模型建模是否成功，在点清各组新生大鼠的死亡数，检查存活率。
取40只妊娠第17天大鼠随机分四组：A.空白组：不做任何处理，大鼠自然分娩；B.对照组：宫窘模型建立后，腹腔注射生理盐水，然后自然分娩。C.对宫窘手术后的大鼠腹腔注射氨茶碱，再自然分娩。D.先对大鼠腹腔注射氨茶碱，再实施宫窘手术，再进行自然分娩。按照分组对新生大鼠进行断头处死，迅速取出肺组织，并用生理盐水洗净，然后将肺组织置于10%中性甲醛固定后石蜡包埋，或将肺组织经液氮速冻后放至-80℃冰箱中保存，用于HE染色和免疫组染色。
1.3计量新生大鼠的体重及肺系数
各组自然分娩的新生大鼠，擦去血清等后称取体重；在断头处死，取其肺组织，用生理盐水漂洗，然后置于滤纸吸干肺组织表面水后称取肺重，计算肺系数，肺系数=肺湿重／体重x100％。
1.4光镜下计数辐射状肺泡
用HE染色法将标本染色固定，切片后置于光镜下，计数自呼吸性细支气管中心到最近纤维膈或胸膜的垂直线上的肺泡数，每组10个标本，每张切片计数5次，取其平均值。
1.5检测肺组织SP-A的表达
切片常规脱蜡、透明至水化，磷酸盐缓冲液冲洗5min，3%H2O2室温下消化15min灭活内源性酶，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min；切片置于0.01mol/L枸盐酸纳溶液（pH：6.0）热修复，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min；胎牛血清封闭30min，以兔抗大鼠SP-A多克隆抗体（1：50）作为一抗，4℃孵育过夜；磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min，加入二抗；磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5min；室温下DAB显色；苏木素轻度复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。阴性对照除了用0.1mol/L磷酸盐缓冲液代替一抗以外，其余所有步骤同上。结果判定：以胞浆内有棕黄色颗粒沉积为阳性细胞。
1.6统计学分析
应用SPSS11.5进行统计分析。各组间比较采用单因素方差分析。进一步比较时，若方差齐采用Dunnett法分析，若方差不齐则进行变量变换，使方差齐后再进行Dunnett法分析。实验数据以x±s表示。P<0.05为有统计学意义。
2、结果与分析
2.1新生大鼠的体重及肺系数
通过对四组新生大鼠的体重进行比较，差异性不大，无统计学意义（P>0．05）；称量新生小鼠肺重并计算肺系数后发现，B组肺系数均较其余三组明显下降，有统计学意义（P<0．05）。实验组C组和D组与对照组比较，肺系数明显升高，有统计学意义（P<0．01）。C组和D组间比较，D组肺系数有所上升，但无统计学差异（P>O．05）。详见表1。
2.3新生大鼠肺组织SP-A的表达
对四组新生大鼠肺组织进行SP-A表达的测定，RT-PCR半定量检测结果显示：空白对照组及实验组C组、D组肺SP-AmRNA表达明显，各组间差异无显著性（P>0．05）。B组对照组新生大鼠肺SP-AmRNA表达减弱，与正常对照组比较差异有显著性（P<0．05）。
3、讨论
本研究结果显示，对受孕的大鼠实施模拟宫窘术后，对新生大鼠的体重影响不大，四组比较无明显差异。但肺系数差异较大，两组应用氨茶碱腹腔注射的实验小鼠肺系数均比对照组和空白组高，特别与对照组差异较为明显。肺形态学数据显示，对照组肺泡病理变化明显，即肺泡间隔变薄，肺泡数目减少，肺泡腔增大。而注射过氨茶碱的新生大鼠肺泡数目较空白组肺泡数目还多，并且形态及肺间质均正常。
宫窘可导致新生大鼠肺组织SP-AmRNA表达下降，但确切机制尚不清楚，可能为缺血缺氧引起肺内炎症细胞聚集等直接或间接损伤肺泡Ⅱ型细胞所致，SP-A蛋白基因的转录受环磷酸腺苷（cAMP）含量的向上调。使用氨茶碱治疗宫窘大鼠后，大鼠肺组织SP-AmRNA表达明显，与正常空白对照组几乎无差异，说明氨茶碱治疗宫窘有一定疗效。
综上所述，宫内窘迫胎鼠运用氨茶碱注射液治疗具有一定可行性，从此次实验可看出，宫窘的大鼠越早应用氨茶碱疗效越好，新生大鼠肺组织功能性越强。但是否在临床上能否产生疗效还仍需进一步的研究实验。
参考文献
[1]李虹娇.甘油果糖对宫内窘迫胎鼠保护作用的研究[D].延边大学，2009.
[2]刘娟娟，赵德育.长期应用糖皮质激素对新生大鼠肺泡形态结构及IGFBP-2的影响[J].南京医科大学学报（自然科学版），2012（4）：463-467.
[3]蔡栩栩，杜悦，高红，等.宫内急性缺血缺氧对新生大鼠肺表面活性蛋白A和B表达的影响[J].中华儿科杂志，2003，41（3）：208-211.
[4]渠红霞，惠宁，崔英，顾清.氨茶碱与地塞米松联用治疗急性胎儿宫内窘迫[J].第二军医大学学报，2001，（01）：79-82.
作者简介：彭江涛（1996—），男，湖南常德人，长沙医学院影像技术在读学生。