来源于Penicillium herquei的郝青霉素酮合成酶PhnH的晶体结构解析

论文摘要

五元环醚是非常重要的结构片段,存在于许多天然产物和具有活性的合成化合物中。五元环醚的合成主要通过4种方式,氧化环合反应、oxa-Michael加成反应、环氧化合物的开环反应、氢烷氧基化反应。在合成化学中,氢烷氧基化反应是形成环醚非常高效的方式。来源于Penicillium herquei NRRL 1040的PhnH被发现能够催化对映选择性氢烷氧基化反应形成herqueinone中的二氢呋喃环,该酶是目前发现唯一能催化氢烷氧基化反应形成环醚的酶。本论文选取来源于Penicillium herquei NRRL 1040的PhnH为研究对象,对其进行表达纯化,并进行晶体结构解析。来源于Penicillium herquei NRRL 1040的PhnH进行生物信息分析后发现N端有信号肽。截去信号肽部分的PhnH构建在pET-32a（+）载体上,转化至工程菌Escherichia coli BL21（DE3）中进行表达。在E.coli BL21（DE3）中的表达条件为诱导温度25℃、IPTG浓度0.5 mmol·L-1、诱导时间18 h。菌体收集破碎后,通过Ni柱亲和层析、TEV酶切除标签、二次Ni柱亲和层析,获得了符合结晶纯度的PhnH。采用坐滴蒸汽扩散法通过晶体筛选试剂盒筛选PhnH结晶条件,发现了4种长晶条件并对其进行了优化。挑选高质量的蛋白晶体在台湾新竹同步辐射中心收到了两组分辨率较好（分别为1.33?和1.44?）的数据。PEG4000的结晶条件长出的晶体收到了分辨率最好的数据,蛋白晶体属于P21空间群,晶胞参数为a=69.57?、b=55.11?、c=70.97?。通过分子置换法解决了相位角问题。PhnH的晶体结构为同源四聚体,与尺寸排阻色谱测定结果一致。PhnH单体结构为一个典型的?桶状折叠,包含9束反平行的?片层和一个310螺旋,形成了一个结构空腔。乙酸铵晶体条件解析出的结构,在PhnH的结构空腔中发现了乙酸根离子,是来自结晶条件中的结晶试剂。相对细菌来源的DUF3237超家族成员,PhnH的结构缺少一个?螺旋而多了一段loop。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
•   1.1 五元环醚的生物合成
•     1.1.1 五元环醚的分布和功能
•     1.1.2 五元环醚的生物合成途径
•     1.1.3 PhnH的研究现状
•   1.2 蛋白质晶体学简介
•     1.2.1 蛋白结晶的基本过程
•     1.2.2 蛋白晶体衍射数据的收集及相角问题
•   1.3 本文研究意义与研究内容
•     1.3.1 PhnH的研究意义
•     1.3.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料及设备
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 溶液及缓冲液配制
•     2.1.5 晶体筛选试剂盒
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 PhnH基本生物信息预测
•     2.2.2 PhnH的克隆表达
•     2.2.3 PhnH的纯化
•     2.2.4 PhnH结晶条件的筛选和优化
•     2.2.5 PhnH晶体X射线衍射数据的收集及处理
•     2.2.6 PhnH相角的确定和结构修正
•     2.2.7 PhnH聚合状态分析
• 第三章 结果与讨论
•   3.1 PhnH生物信息学分析
•   3.2 PhnH的克隆表达
•   3.3 PhnH的纯化
•   3.4 PhnH结晶条件的筛选与优化
•     3.4.1 PhnH结晶条件的筛选
•     3.4.2 PhnH结晶条件的优化
•   3.5 PhnH蛋白晶体的X-衍射与结构分析
•     3.5.1 蛋白晶体衍射数据的收集及处理
•     3.5.2 PhnH的结构分析
•   3.6 PhnH与底物类似物复合体结构初步分析
•     3.6.1 底物浸泡法
•     3.6.2 共结晶法
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：在学期间发表的与学位论文相关的研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 冯永

导师: 李华钟

关键词: 氢烷氧基化反应,蛋白纯化,晶体结构解析

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学

单位: 江南大学

分类号: O641.3;Q811.4

总页数: 45

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