一、Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α and Its Relationship to Apoptosis and Proliferation in Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma（论文文献综述）
Yiyuan Yuan,Huimin Li,Wang Pu,Leilei Chen,Dong Guo,Hongfei Jiang,Bo He,Siyuan Qin,Kui Wang,Na Li,Jingwei Feng,Jing Wen,Shipeng Cheng,Yaguang Zhang,Weiwei Yang,Dan Ye,Zhimin Lu,Canhua Huang,Jun Mei,Hua-Feng Zhang,Ping Gao,Peng Jiang,Shicheng Su,Bing Sun,Shi-Min Zhao[1]（2022）在《Cancer metabolism and tumor microenvironment:fostering each other?》文中研究指明The changes associated with malignancy are not only in cancer cells but also in environment in which cancer cells live.Metabolic reprogramming supports tumor cells’ high demand of biogenesis for their rapid proliferation,and helps tumor cells to survive under certain genetic or environmental stresses.Emerging evidence suggests that metabolic alteration is ultimately and tightly associated with genetic changes,in particular the dysregulation of key oncogenic and tumor suppressive signaling pathways.Cancer cells activate HIF signaling even in the presence of oxygen and in the absence of growth factor stimulation.This cancer metabolic phenotype,described firstly by German physiologist Otto Warburg,ensures enhanced glycolytic metabolism for the biosynthesis of macromolecules.The conception of metabolite signaling,i.e.,metabolites are regulators of cell signaling,provides novel insights into how reactive oxygen species（ROS） and other metabolites deregulation may regulate redox homeostasis,epigenetics,and proliferation of cancer cells.Moreover,the unveiling of noncanonical functions of metabolic enzymes,such as the moonlighting functions of phosphoglycerate kinase 1（PGK1）,reassures the importance of metabolism in cancer development.The metabolic,micro RNAs,and nc RNAs alterations in cancer cells can be sorted and delivered either to intercellular matrix or to cancer adjacent cells to shape cancer microenvironment via media such as exosome.Among them,cancer microenvironmental cells are immune cells which exert profound effects on cancer cells.Understanding of all these processes is a prerequisite for the development of a more effective strategy to contain cancers.
匡彦蓓[2]（2021）在《p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究》文中研究表明放射治疗是治疗癌症的一种常用手段,超过50%的癌症患者需要采用放疗技术进行治疗。放疗不仅可以单独作为一种治疗策略来缩小肿瘤体积,也经常与手术切除以及化学药物治疗联合应用,来达到最佳的治疗效果。因此,放疗是一种非常重要的癌症治疗手段。随着对放疗研究的深入,越来越多的证据表明,放疗失败的主要原因之一是肿瘤乏氧微环境。肿瘤乏氧微环境会造成肿瘤细胞的葡萄糖代谢途径重编程,即原本占代谢主导地位的线粒体氧化磷酸化过程被抑制,而糖酵解途径被增强。代谢途径的改变可以满足肿瘤细胞快速增殖所需的大量能量和代谢物质,并且通过多种途径增加肿瘤的辐射抗性。因此,本研究的目的在于筛选与肿瘤乏氧及辐射敏感性相关的分子标志物,并探究该分子标志物增强乏氧肿瘤辐射抗性的分子机制,为乏氧肿瘤的放射治疗提供新的理论依据。胶质瘤是常见的颅内肿瘤,其中胶质母细胞瘤是最致命的肿瘤之一。高级别胶质瘤患者预后差的主要原因是肿瘤的抗药性和辐射抗性强,治疗后极易复发,随后造成患者死亡。胶质瘤是常见的以乏氧为特征的实体肿瘤,其乏氧程度和肿瘤恶性程度密切相关,肿瘤内部氧分压越低的胶质瘤恶性程度越严重。因此,胶质瘤复发的主要原因之一是乏氧肿瘤微环境增强了胶质瘤的辐射抗性,在放疗后仍有一些肿瘤细胞未被清除,造成复发。因此,本研究以胶质瘤细胞作为实验材料来研究乏氧增强肿瘤细胞辐射抗性的机制。我们首先利用生物信息学分析胶质瘤患者肿瘤组织中的基因表达情况,筛选出一部分与胶质瘤发生发展具有密切关系的蛋白分子。随后在胶质瘤细胞中验证了待选分子中p21蛋白在乏氧处理后表达量显着升高,即p21可以参与胶质瘤细胞对乏氧处理的应答。然后通过克隆存活实验,发现p21能够增强胶质瘤细胞在乏氧条件下的辐射抗性。实验过程中还发现调控p21可以改变乏氧条件下细胞培养基的酸化程度,因此推测p21很有可能参与乏氧条件下糖酵解途径的调控。通过检测胶质瘤细胞培养基中一定时间内乳酸的产量以及细胞对葡萄糖的摄入量,我们证实p21的确参与了糖酵解途径的调控。通过Real-time PCR技术和免疫印迹杂交技术,我们发现p21能够在乏氧条件下上调Glut1和LDHA来促进胶质瘤细胞在乏氧条件下的糖酵解。后续的实验也证明p21调控的糖酵解途径的确能够增强胶质瘤细胞在乏氧条件下的辐射抗性。因此,p21在乏氧条件下通过促进胶质瘤细胞的糖酵解途径增强肿瘤的辐射抗性。在分子机制方面,我们通过双荧光素酶报告基因系统验证了p21在乏氧条件下的表达升高是由于乏氧诱导因子HIF-1α直接结合在其启动子上并激活其转录。有趣的是,我们还发现被HIF-1α转录激活的p21能够反过来促进HIF-1α的转录,并且是乏氧条件下HIF-1α转录所必需的。因此,HIF-1α与p21之间存在着相互作用的正反馈调节回路。众所周知,HIF-1α是调控糖酵解途径的重要分子,HIF-1α能够与Glut1和LDHA的启动子结合并激活其转录。所以,HIF-1α与p21之间的正反馈调节回路能够增强乏氧条件下胶质瘤细胞内的糖酵解途径。为了验证上述在细胞和分子水平得到的结论,我们构建了能够稳定过表达p21的胶质瘤细胞用于动物实验。动物实验的结果表明,过表达p21可以增强胶质瘤的辐射抗性。通过对瘤体进行免疫组化染色,发现p21过表达的肿瘤中,HIF-1α、Glut1和LDHA的表达量均高于对照组。动物实验的结果与细胞水平的结果一致,因此我们得出结论:在胶质瘤中,p21与HIF-1α之间相互作用的正反馈调节回路通过促进糖酵解途径增强了乏氧导致的辐射抗性。
李雅[3]（2021）在《靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究》文中提出研究目的肝细胞癌（Hepatocellular carcinomα,HCC）是一种高发生率及高死亡率的原发性肝癌。在全球范围内,每年死于肝癌的患者数目超过80万,在各种恶性肿瘤中死亡率位居第一。目前,临床上除手术切除病灶、经导管肝动脉化疗栓塞术及肝移植等治疗手段外,索拉非尼和乐伐替尼是被FDA批准用于治疗晚期HCC的一线化学药物。临床仅不足30%的患者可以手术治疗,而索拉非尼对患者生存期的延长有限,总生存期仅延长2.3～2.7个月。另外,现有的手术、化疗或放疗的治疗方式对肝癌的转移和复发却难以产生有效的抑制作用。因此,探索肝癌的发生发展机制、寻找潜在的干预靶点或治疗手段极为重要。有研究证实,在铂类、蒽环类等化学药物或放射治疗肿瘤时,肿瘤细胞可发生免疫原性死亡,即肿瘤细胞在发生凋亡的同时,由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞。免疫原性死亡的肿瘤细胞表面高表达钙网蛋白（Calreticulin,CRT）、内质网中蛋白二硫化异构酶（Endoplasmic reticulum resident protein 57,ERp57）、热休克蛋白（Heat shock proteins,HSPs）、高迁移率族迁徙族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB-1）等特征性的蛋白分子,这些分子能激发机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别与攻击。Calreticulin和ERp57等被作为“eat me”信号分子,促进肿瘤细胞对DC的粘附,激活DC的MHC-I抗原呈递信号通路,从而活化CD8+T细胞。肿瘤细胞膜上的糖蛋白CD47由于能抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,因而被认为是一种“don’t eat me”信号。死亡的肿瘤细胞释放的ATP可通过P2Y2嘌呤受体促进DC的募集被称作“find me”信号分子。细胞在发生免疫原性死亡早期,作为“eat me”信号的calreticulin和ERp57等在大量转移到细胞表面的同时,细胞膜上CD47的表达水平显着性下降,“don’t eat me”信号和“eat me”信号的此消彼长,使得肿瘤细胞能被DC和巨噬细胞有效识别和吞噬。因此,诱导免疫原性肿瘤细胞死亡是抗肿瘤治疗的目标之一,该作用可以通过激活机体免疫系统产生更强而有效的抗肿瘤效应。信号传导及转录激活因子 3（Signal transducer and activator of transcription,STAT）STAT3是STAT家族的重要成员,其在肿瘤组织中的异常持续激活,可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核转导,促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,这与恶性肿瘤的发生发展密切相关。约60%的肝癌患者伴有STAT3高表达,并与不良预后呈正相关。我们之前的研究也证明,阻断STAT3可以通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制HCC的增殖;另外,阻断HCC中STAT3信号通路可以明显提高NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答;并且,阻断STAT3的HCC可以诱导抗肿瘤免疫记忆、改善肿瘤免疫微环境。然而,该过程是否与免疫原性死亡有关尚未进行深入的研究。Napabucasin是一种口服的针对STAT3和癌细胞多能性的抑制剂,可下调STAT3驱动的干细胞基因表达和自我更新能力,并诱导细胞死亡。Li等在体内外证实,Napabucasin通过阻断STAT3信号抑制胰腺癌、咽鳞癌、结直肠癌等肿瘤干性特征,进一步影响肿瘤的复发和转移。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中,Napabucasin针对胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种转移性实体瘤疗效显着,控制率均达到80%以上。然而,Napabucasin对肝癌的治疗是否有效尚未见报道。鉴于STAT3在肝癌发生发展中的重要作用,我们推测Napabucasin有望应用于肝癌的治疗。因此,本研究利用携带STAT3-shRNA的慢病毒和新型小分子抑制剂Napabucasin阻断肝癌细胞中STAT3信号通路,在体内外模型中观察其是否可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡,并深入阐述其作用机制;进一步,系统评价了Napabucasin对肝癌干细胞特征的影响。该研究为肝细胞癌的治疗提供了有潜力的靶点,也为Napabucasin对肝癌治疗的临床应用提供良好的实验依据。研究方法1.利用携带STAT3-shRNA的慢病毒感染Huh7和HepG2.2.15肝癌细胞系,48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平,其中挽救实验使用携带STAT3-WT和STAT3-Y705F的慢病毒感染STAT3干扰组细胞;CCK-8和Annexin-V/PI标记分别检测细胞的增殖和凋亡;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90 和 CD47 的表达变化;ELISA 检测细胞培养上清中ATP的分泌水平。2.从健康志愿者外周血中分离单个核细胞,诱导形成未成熟的hDC,与Huh7和HepG2.2.15细胞共孵育48h后,流式细胞术检测hDC细胞表面CD80和CD86的表达变化。3.使用PMA诱导THP-1形成贴壁巨噬细胞,并进行CM-Dil染料进行标记,与CFSE标记的肝癌细胞共孵育2小时后,流式细胞术检测巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬情况。4.利用 western bloting 检测 Huh7 和 HepG2.2.15 细胞中 STAT3/p-STAT3、PKR/p-PKR、eIF2α/p-eIF2α 的表达水平;IP 和 GST pull-down 实验观察 STAT3与PKR的结合作用。5.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中STAT3与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析CD47的启动子序列,进一步应用ChIP实验鉴定STAT3是否直接与CD47的启动子序列结合。6.不同浓度的2-DG处理Huh7和HepG2.2.15细胞0-72h,CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞表面calreticulin和CD47的表达变化。7.应用Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测Huh7和HepG2.2.15细胞的糖酵解水平。8.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的表达水平及与病人生存期的相关性;分析肝癌患者癌组织中STAT3与HIF-1α、LDHA表达水平的相关性。9.应用RT-qPCR技术检测Huh7和HepG2.2.15细胞中糖酵解相关分子HIF-1α、GLUT 1、HK2 和 LDHA 的 mRNA 水平。10.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中GLUT1与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析GLUT1的启动子序列,进一步应用ChIP实验观察STAT3是否直接与GLUT1的启动子序列结合。11.以人肝癌细胞系Huh7、HepG2和HepG2.2.15,以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6 为研究对象,CCK-8 检测 Napabucasin、Cryptotanshinone 和 Oxaliplatin处理上述肝癌细胞系48h后的细胞活力。12.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞 12h 后,western bloting检测细胞中STAT3/p-STAT3Tyr705的水平;PI标记分析细胞周期;Annexin-V/PI标记检测细胞凋亡情况;Hoechst标记观察细胞核固缩情况;RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;细胞集落形成实验和细胞成球实验分别检测细胞集落形成抑制率和细胞成球率。13.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞球后,RT-qPCR 技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;JuLITM Stage实时检测细胞球形态;CCK-8检测细胞球活力。14.应用 RT-qPCR技术检测 HepG2.2.15 细胞中 HBx、HBc 和 HBs/p 的 mRNA水平。15.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞后,Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测细胞糖酵解水平;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达变化;与DC共孵育48h后,流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的表达变化。16.利用携带STAT3-shRNA的质粒转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞,48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平;流式细胞术检测细胞表面 calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90 和 CD47 的表达变化。17.从C57BL/6J小鼠骨髓中分离骨髓细胞,诱导培养形成未成熟的mDC,与Hepa1-6细胞共孵育48h后,流式细胞术检测mDC细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的表达变化。18.使用Hepal-6细胞构建C57BL/6J肝脏原位移植瘤小鼠模型,于2周后腹腔注射20mg/kg的Napabucasin,每2天一次,连续治疗8次;分离小鼠肝脏的肝细胞,流式细胞术检测CD95和PD-L1表达水平;分离小鼠肝脏中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析巨噬细胞、DC和CD8+T细胞的浸润量及活化水平。19.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J皮下移植瘤小鼠模型,第5天开始给予药物治疗,每2天给予小鼠腹腔注射20mg/kg的Napabucasin,连续8次。随后,将小鼠分为两组,一组小鼠剥离其皮下肿瘤,并于1周后在另一侧皮下注射Hepa1-6细胞观察肿瘤复发情况,另一组小鼠用于生存期观察。20.对剥离的小鼠皮下移植瘤组织进行免疫荧光组织化学检测,分析calreticulin、ERp57、CD47和GLUT1的表达水平;分离皮下移植瘤中的肿瘤细胞,流式细胞术检测Ki67、CD95和PD-L1表达水平;RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平。21.分离小鼠皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的浸润量及活化情况;流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞的浸润量及免疫抑制功能状态。22.对Hepa1-6细胞构建的皮下移植瘤小鼠模型,第12天皮下形成明显肿瘤块时给予腹腔注射Napabucasin治疗,每2天一次,连续治疗8次。随后,剥离小鼠皮下移植瘤组织分别进行HE和Tunel染色分析肿瘤病理和细胞凋亡情况;分离皮下移植瘤中肿瘤细胞,RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平;分离皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析CD8+T和NK细胞的浸润量及活化情况。研究结果1.靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡干扰人肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞中STAT3信号通路可以显着性抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,同时促进calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90等“eat me”信号分子的膜转移,促进ATP向细胞外的释放。另外,干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可以促进其对DC的活化作用,增加DC表面CD80和CD86的表达。我们观察到“don’t eat me”信号分子CD47在肝癌患者肿瘤组织中高表达,并与STAT3的表达水平呈正相关;CHIP实验证实,STAT3可通过与CD47的启动子区域结合直接调控CD47的转录与表达。因此,干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可降低CD47在细胞表面的表达,促进巨噬细胞对其的吞噬。2.STAT3通过与PKR形成复合物调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化STAT3通过与eIF2α的上游调节分子PKR结合形成STAT3-PKR复合物,从而调节游离的PKR及其磷酸化水平,进一步调控eIF2α的磷酸化水平。干扰STAT3在Huh7和HepG2.2.15细胞的表达,可以减少STAT3-PKR复合物的形成,使游离的PKR及pPKR增多,从而促进免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化。3.STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制HCC免疫原性死亡与正常组织相比,肝癌患者肿瘤组织中糖酵解关键酶HIF-1α、GLUT1、HK2表达水平明显升高,且癌组织中高表达GLUT1、HK2和LDHA的肝癌患者往往伴随着生存期缩短。另外,肝癌患者的癌组织中STAT3与HIF-1α和LDHA的表达水平呈正相关。干扰Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3信号通路,显着性降低糖酵解相关的关键分子HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的mRNA水平,伴随肝癌细胞的糖酵解水平和最大糖酵解能力均明显降低。糖酵解阻断剂2-DG可抑制Huh7和HepG2.2.15细胞的增殖,并诱导肝癌细胞免疫原性死亡。TCGA数据库显示,肝癌患者的癌组织中GLUT1与CD47的表达水平呈正相关。GLUT1抑制剂STF-31可以显着性增加calreticulin在HepG2.2.15细胞表面的表达,而降低CD47的表达水平。进一步通过CHIP实验证实,STAT3可通过与GLUT1的启动子区域结合直接调控GLUT1的转录与表达。4.STAT3抑制剂Napabucasin体内外诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境Napabucasin可显着性增加Huh7和HepG2.2.15以及Hepa1-6细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达量,促进肝癌细胞对DC的活化作用。在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠模型中,Napabucasin治疗组小鼠肿瘤的生长速度低于溶剂对照组,并且肿瘤细胞表面calreticulin和ERp57的表达水平明显升高,而CD47和GLUT1的水平显着性降低;肿瘤浸润的CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+DC细胞明显增加且活化水平提高,同时肿瘤浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量明显增加,并且具有免疫抑制功能的LAG-3、PD1和KLRG1在CD8+T细胞上的表达较对照组均明显减少。进一步,在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠Rechallenge实验中,Napabucasin治疗组中有75%的小鼠能抵抗第二次接种的Hepa1-6细胞的生长,而溶剂对照组小鼠100%出现肿瘤复发的情况。虽然,Napabucasin在对晚期给予Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠治疗中没有表现出明显的抑制作用,但是可以促进NK细胞的肿瘤浸润,并具有免疫抑制功能的LAG-3、Tim-3在CD8+T细胞和NK细胞上的表达降低,而IFNγ的表达水平的提高。5.STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答在Hepal-6细胞肝脏原位移植瘤小鼠中,Napabucasin治疗可以明显缩小肝脏癌变组织的大小,并伴随CD95+肝细胞数的增加和PD-L1+肝细胞数的减少。同时,Napabucasin治疗组小鼠肝脏中巨噬细胞的浸润数量及表达共刺激分子CD86的表达水平都明显高于溶剂对照组。另外,两组小鼠肝脏中浸润的DC数量虽然明显差异,但Napabucasin治疗组小鼠肝脏中浸润的DC表达的CD80和MHCⅡ的水平较溶剂对照组明显增加。更为重要的是,Napabucasin治疗组小鼠肝脏中CD8+T细胞数量明显增多,并且免疫抑制受体PD-1和LAG-3在CD8+T细胞上的表达降低。6.STAT3抑制剂Napabucasin显着抑制肝癌细胞的干性特征体外实验发现 Napabucasin 抑制 Huh7、SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15和Hepa1-6等肝癌细胞的活力作用强于Cryptotanshinone和Oxaliplatin,其IC50值明显低于另外两种药物。同时,Napabucasin可以抑制Huh7、HepG2.2.15和Hepal-6细胞的集落形成以及成球数,并可以裂解肝癌细胞球体。进一步分析发现,Napabucasin可以抑制Huh7和Hepa1-6细胞及细胞球体中Nanog、Sox-2和OCT4等肿瘤干性相关分子的mRNA水平。7.STAT3抑制剂Napabucasin可抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤生长早期给予Napabucasin治疗可明显抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存期。Napabucasin治疗组小鼠肿瘤组织中Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平明显降低,并伴随CD95+肿瘤细胞数的增加和Ki67+、PD-L1+肿瘤细胞数的减少。晚期给予Napabucasin治疗,可以增加肿瘤组织中细胞凋亡数目及坏死区域,与早期治疗结果一致,Napabucasin可以抑制肿瘤组织中干性相关分子的表达。结论在本研究证明干扰STAT3信号通路可诱导肝癌细胞免疫原性死亡,表现为作为“eat me”信号的calreticulin和ERp57等大量转移到细胞表面,而细胞膜上“don’t eat me”信号分子CD47的表达水平显着性下降,且STAT3可以直接靶向CD47启动子;同时,细胞培养上清中作为“find me”信号的ATP释放增加,促使肝癌细胞被DC和巨噬细胞对肿瘤细胞的有效识别和吞噬。另外,干扰STAT3信号通路可降低肝癌细胞糖酵解关键酶水平,降低糖酵解水平,促进肿瘤细胞免疫原性死亡,并且STAT3可直接调控GLUT1的转录。进一步,利用小鼠皮下移植瘤和肝脏原位移植瘤模型证明,STAT3抑制剂Napabucasin处理可以增加肿瘤组织中DC和巨噬细胞的浸润数量及抗原呈递功能,促进CD4+T和CD8+T细胞在肿瘤组织的募集,减少KLRG1+及免疫抑制受体LAG-3+、PD1+的CD8+T细胞数,并产生抗肿瘤的免疫记忆作用。另外,Napabucasin在抑制Hepa1-6细胞的生长的同时,还可以抑制肿瘤干细胞的形成,延长小鼠生存期。意义该研究证明,靶向STAT3信号通路可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡,改善肿瘤免疫微环境,逆转肿瘤的免疫耐受状态,在机体产生抗肿瘤免疫记忆中发挥着极为重要的作用,为STAT3作为肝癌治疗靶点及Napabucasin的临床应用提供了充分的理论依据和详实的实验依据,也为下一步建立新的肝癌治疗策略提供新思路。
史新萌,刘玉萍,瞿鼎,黄琳清,陈彦[4]（2021）在《抑制HIF-1α表达的中药抗肿瘤活性成分研究进展》文中进行了进一步梳理实体肿瘤的重要特征之一是缺氧,缺氧微环境可导致缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α）的过度表达。HIF-1α是缺氧应答中最为关键的转录因子,可通过激活下游基因表达促进肿瘤细胞异常增殖、肿瘤血管生成、能量代谢异常、耐药性增加、侵袭和转移。因此,下调HIF-1α的表达是一条目前被认为治疗实体肿瘤的很有前景的途径。然而,大多数现有的HIF-1α抑制剂的临床效果受到低效性和高毒性的限制。由此,针对HIF-1α的过度表达研发强效安全的新型药物尤为重要。近年来,大量研究发现多种中药化学成分可直接或间接抑制HIF-1α的激活,在对抗低氧诱导的肿瘤进展过程方面具有广阔的前景。本综述汇总了近十年内直接或间接抑制HIF-1α表达的各种中药抗肿瘤活性成分的研究进展,并进行总结与讨论,以期为进一步研究作为参考。
李晓琳[5]（2020）在《骨桥蛋白通过PI3K/AKT通路上调HIF-1α表达促进食管癌放疗抵抗》文中指出食管癌是我国常见病及高发病,全球近一半的食管癌新增和死亡病例均发生在中国,严重影响广大人民群众的健康和社会、经济发展。多数患者就诊时已为局部晚期食管癌,根治性放化疗是其主要治疗手段,但局部失败率较高。乏氧是实体瘤中普遍存在的现象,多项研究证实:食管癌中肿瘤乏氧区域的存在可导致较差的预后。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）作为乏氧相关因子,在多种癌症中表达的增加与肿瘤的发生,发展和转移密切相关,同时OPN表达水平被认为与肿瘤较差的预后相关。但能否作为食管癌乏氧增敏放射治疗疗效的预测因子尚无明确定论。乏氧诱导因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α）是乏氧诱导的放疗抵抗的核心研究分子。乳腺癌中OPN可诱导HIF-1α及血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）高表达,从而使细胞侵袭和转移能力增加。但OPN对食管癌放疗敏感性的影响及机制尚不明确。因此,本研究从临床方向,研究OPN对食管鳞癌放疗增敏疗效及预后的预测价值。并在基础研究方向,探索OPN对食管癌放疗敏感性的影响及机制,并对结果进行验证。从而对局部晚期食管鳞癌患者个体化放疗增敏提供理论依据。目的本课题通过前瞻性临床研究,分析局部晚期食管鳞癌患者OPN表达和乏氧微环境（HIF-1α、VEGF）的相关性,比较不同OPN表达患者放疗增敏的近期疗效和远期生存,评估OPN的预测价值。通过食管癌细胞体外实验,阐明OPN诱导HIF-1α高表达,对放疗敏感性的影响及作用机制。通过荷瘤鼠体内实验,比较OPN表达不同的肿瘤放疗后生长曲线的差异,以及与HIF-1α等机制分子的相关性分析,验证OPN促进HIF-1α高表达对食管鳞癌放疗敏感性的影响。方法1.本研究前瞻性入组局部晚期食管癌患者。治疗前留取患者血清样本进行OPN检测病理组织标本中免疫组化检测乏氧相关指标OPN、HIF-1α、以及VEGF表达。治疗前行全身PET-CT检查。随机分为甘氨双唑钠（Sodium glycididazole,CMN）联合根治性同步放化疗组（增敏组）和根治性同步放化疗组（对照组）。主要研究终点为客观缓解率（Objective Response Rate,ORR）,次要终点为总生存（Overall Survival,OS）、无进展生存（Progression Free Survival,PFS）和安全性分析。明确OPN对局部晚期食管鳞癌放疗增敏的指导意义。2.通过The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库,提取食管鳞癌相关数据,对比食管癌和正常组织,以及不同分期食管癌之间OPN表达差异,并通过基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）与OPN高表达密切相关的信号通路。3.筛选OPN低表达的TE-1细胞和OPN高表达的KYSE150细胞,通过流式细胞分析检测两组细胞放疗后的基线凋亡能力,通过克隆形成实验检测两组细胞在不同放疗剂量下的基线克隆形成能力。分别构建稳定转染的TE-1 oe-OPN细胞、TE-1 NC细胞和KYSE150 shOPN细胞、KYSE150 NC细胞。通过放疗后克隆形成实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后克隆形成能力的差异。通过TUNEL实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后凋亡的差异。通过蛋白免疫印迹实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后凋亡蛋白表达的差异。为明确OPN对HIF-1α蛋白表达的影响,在常氧条件下加入不同剂量重组人OPN,通过蛋白免疫印迹实验检测两组细胞HIF-1α及VEGF的表达。并通过蛋白免疫印迹实验检测上调及沉默OPN后食管癌细胞HIF-1α及VEGF的表达。HIF-1α受多条信号通路调控,PI3K和MAPK通路可能是乏氧状态下调控HIF-1α影响放疗敏感性的主要两条通路。为进一步明确OPN调控HIF-1α表达的通路分子,并深入研究分子机制。结合生物信息分析结果,给予TE-1细胞及KYSE150细胞重组人OPN培养后,选择PI3K和MAPK通路抑制剂,蛋白免疫印迹实验检测HIF-1α的表达,筛选OPN主要通过哪一个通路分子调控HIF-1α表达。并通过蛋白免疫印迹实验进一步检测该通路分子及下游分子磷酸化表达。由于乏氧是HIF-1α的主要调控因素,因此在乏氧状态下,通过蛋白免疫印迹实验检测OPN上调及沉默后HIF-1 α的表达,并通过蛋白免疫印迹实验检测通路分子的磷酸化情况,明确OPN和乏氧对HIF-1α调控的协同作用。随后,分别应用该通路分子抑制剂和重组人OPN,对TE-1 NC细胞、TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150NC细胞、KYSE150 shOPN细胞进行放疗后克隆形成能力的挽救实验,TUNEL检测放疗后各组细胞凋亡能力的恢复。4.体外实验构建的稳转TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150 shOPN细胞以及空白对照组细胞进行裸鼠成瘤。移植瘤放疗后记录肿瘤直径并计算肿瘤体积,比较不同OPN表达肿瘤放疗后生长速度和体积,验证OPN对食管癌放疗敏感性的影响。免疫组化检测不同OPN表达肿瘤组织HIF-1α、p-AKT、VEGF的表达,分析OPN和肿瘤乏氧微环境的相关性。结果1.自2016年至2018年,共入组了 78例患者,其中66例患者纳入进一步统计分析。随机分为甘氨双唑钠联合同步放化疗组（增敏组）和同步放化疗组（对照组）,两组患者之间的基线特征无明显差异。增敏组患者对CMN耐受性良好。增敏组的客观缓解率达到90.32%,对照组的客观缓解率为68.57%。两组之间差异有统计学意义χ2=4.925,P=0.027。然而两组之间的CR率（χ2=0.078,P=0.780）和PR率（χ2=2.344,P=0.126）无明显差异。随访时间截止至2019年11月,两组患者中位的总生存时间为23.37个月,95%CI 18.57-NA。增敏组的中位OS为19.93个月（95%CI 16.33-28）,而在对照组,中位OS尚未达到。增敏组的中位PFS为14.27个月（95%CI 9.57-27.77）,对照组中位PFS为16.23个月（95%CI 10.833-NA）。增敏组和对照组之间的OS（χ2=1.432,P=0.234）及PFS（χ2=0.538,P=0.464）无明显统计学差异。血清OPN相关亚组分析结果显示,入组患者血清OPN中位值为94.87ng/ml,表达范围为9.67-253.47 ng/ml。通过受试者工作特征曲线分析（Receiver operating characteristic curve,ROC）曲线分析血清 OPN 界值为 84.72ng/ml,P=0.002。血清OPN低组ORR率为89.66%,而血清OPN高组ORR率为71.80%,两组之间ORR差异无显着统计学意义（χ2=2.790,P=0.095）。血清OPN高表达患者组,在应用CMN后,较对照组的ORR明显改善（Fisher的精确检验,P=0.033）。而本身血清OPN低表达组患者,应用CMN后,与对照组ORR无差异（Fisher的精确检验,P=0.529）。生存分析结果显示血清OPN高组患者的OS（χ2=17.042,P<0.001）及PFS（χ2=13.563,P<0.001）明显低于OPN低组患者。在增敏组,OPN高表达和低表达亚组之间OS无明显差异（P>0.05）,但在对照组,OPN高表达和低表达亚组OS差异仍非常明显（P<0.001）。本研究检测了 54例入组患者食管癌病理组织的OPN、HIF-1α、VEGF的表达。结果显示组织OPN和血清OPN表达具有相关性r=0.549,P<0.001。在OPN高表达的食管鳞癌患者中,组织HIF-1α表达升高（r=0.537,P<0.001）,VEGF表达略有升高（r=0.271,P<0.050）。进一步分析组织OPN高表达组的ORR率明显低于组织OPN低表达组,差异有明显统计学意义（χ2=9.429,P=0.002）。组织高表达OPN组患者,应用CMN后,其ORR较对照组ORR明显改善（χ2=5.372,P=0.020）,但在组织低OPN表达组患者,应用CMN后,两组ORR无明显差异（Fisher的精确检验,P=1.000）。生存分析结果显示,组织OPN高表达患者的OS明显差于组织OPN低表达组患者（χ2=15.258,P<0.001）。亚组分析结果显示,在应用CMN增敏后,OPN表达的不同患者之间OS无明显差异（P>0.05）。但在对照组,组织OPN表达不同的患者OS差异仍非常明显（P<0.001）。单因素及多因素分析结果显示血清OPN、组织OPN和组织HIF-1α表达均为食管鳞癌患者预后不良的预测因素。2.通过对TCGA数据库中食管鳞癌组织和正常组织的SPP1基因（OPN的基因）表达分析,食管鳞癌中SPP1基因表达较正常组织明显升高（P<0.001）。局部晚期食管鳞癌患者的SPP1基因表达高于早期以及发生转移的晚期患者（P<0.001）。SPP1表达水平高的患者的生存率要明显差于SPP1低表达患者（P=0.004）。SPP1表达升高时,与乏氧及PI3K/AKT通路活化明显相关。3.通过筛选不同OPN表达的4种食管鳞癌细胞系,选择OPN低表达的TE-1细胞和OPN高表达的KYSE150细胞系。放疗后,两组细胞克隆形成能力均明显减低,凋亡明显增加。成功构建稳转OPN高表达的TE-1 oe-OPN细胞以及TE-1 NC细胞,同时构建稳转KYSE150-shOPN细胞和KYSE150NC细胞。TE-1 oe-OPN克隆形成率在放疗2Gy、4Gy、6Gy及8Gy剂量下较TE-1 NC和TE-1明显升高,放疗后凋亡率明显降低;而KYSE150 shOPN细胞放疗后克隆形成能力较KYSE150 NC和KYSE150明显降低,放疗后凋亡率明显升高。TE-1 oe-OPN细胞放疗后凋亡促进蛋白Bax较TE-1 NC和TE-1降低,而凋亡抑制蛋白Bcl-2升高。KYSE150-shOPN细胞放疗后Bax蛋白表达较TE-1 NC和TE-1明显升高,Bcl-2蛋白表达量明显降低。常氧及乏氧下,TE-1细胞和KYSE150细胞分别加入不同剂量人重组OPN处理后,HIF-1α及VEGF蛋白表达均升高,和OPN剂量呈正相关趋势。稳转TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150 shOPN细胞的HIF-1α蛋白表达与OPN趋势一致。PI3K抑制剂LY294002可以明显降低由OPN诱导的HIF-1α蛋白表达,且OPN高表达后,PI3K/AKT通路p-ILK、p-AKT、p-P65活性增强。放疗敏感性挽救实验显示,LY294002可以降低TE-1 oe-OPN细胞放疗后克隆形成率,升高凋亡水平,恢复至TE-1 NC水平。在KYSE150 shOPN细胞中,加入重组人OPN,可以恢复其放疗后克隆形成率及凋亡水平至KYSE150 NC水平。4.荷瘤鼠体内实验结果显示,KYSE150肿瘤对照组平均体积为1736.65±102.49 mm3。KYSE150 shOPN细胞成瘤后生长速度及体积较KYSE150及KYSE150 NC略小,但在肿瘤体积至500mm3前各组细胞肿瘤生长速度和体积差异并无统计学意义。KYSE150肿瘤放疗后平均体积为928.88±62.41 mm3,对比KYSE150 shOPN肿瘤放疗后平均体积为688.89±37.94 mm3（P<0.001）。肿瘤生长曲线结果显示在TE-1和TE-1 oe-OPN肿瘤放疗前生长速度及体积无明显差异。放疗后TE-1放疗组肿瘤平均体积为359.04±96.00,放疗后TE-1oe-OPN肿瘤平均体积为873.45±126.65 mm3,明显大于放疗后TE-1肿瘤的体积（P<0.001）。免疫组化结果显示 TE-1 oe-OPN 肿瘤的 HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34表达的强度和范围较TE-1细胞的肿瘤都明显增强。KYSE15 shOPN肿瘤的HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34表达呈明显降低的趋势。结论临床研究表明,局部晚期食管鳞癌患者中,OPN表达和食管鳞癌乏氧微环境（HIF-1α、VEGF）相关。OPN高表达患者ORR及OS较差,应用CMN增敏可改善ORR和生存。OPN对局部晚期食管鳞癌患者同步放化疗增敏疗效和预后有预测价值。体外研究发现,食管癌TE-1细胞和KYSE150细胞中,常氧下OPN高表达可导致食管鳞癌细胞PI3K/AKT通路磷酸化增强,诱导HIF-1α、VEGF蛋白表达明显升高,导致放疗抵抗。在乏氧状态下OPN诱导HIF-1 α高表达作用得到加强。PI3K抑制剂LY294002可以改善OPN高表达导致的食管鳞癌细胞放疗抵抗。体内研究证实,裸鼠食管癌模型中,OPN和乏氧微环境因子HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34的表达趋势一致。OPN高表达可以促进荷瘤鼠食管鳞癌的放疗抵抗。
步明强[6]（2020）在《缺氧通过HIF-1α-fascin-1环路促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究》文中研究表明第一部分 Fascin-1促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究实验目的:Fascin-1是一种肌动蛋白成束蛋白,主要与F-actin结合并连接成有序、平行的微丝束,参与细胞粘附和细胞迁移的调控,在多种肿瘤呈高表达,并与肿瘤的侵袭转移密切相关。然而fascin-1在下咽鳞癌组织中的表达情况以及fascin-1在下咽癌侵袭和转移中的内在分子机制尚不明确。因此,本实验主要研究以下二个方面的内容:1、探讨fascin-1在下咽鳞癌组织的表达及其与临床病理资料和预后的关系;2、探讨fascin-1表达变化对下咽癌FaDu细胞形态、迁移和侵袭能力的影响以及fascin-1促进下咽癌侵袭和转移的内在分子机制。实验方法:1、以96例下咽鳞癌组织标本为研究对象,采用免疫组织化学法,检测fascin-1蛋白在下咽鳞癌癌组织和癌旁组织的表达情况,并进一步分析其表达与下咽鳞癌临床病理资料（年龄,性别、肿瘤大小、临床分期、病理分级、颈淋巴结转移、肺转移）及预后的关系。2、以下咽癌FaDu细胞系为研究对象,分别应用fascin-1 siRNA和fascin-1过表达质粒转染下咽癌FaDu细胞,沉默或上调fascin-1表达,并设置对照组。（1）应用 Western blot 法,检测 fascin-1 siRNA 和 fascin-1 过表达质粒转染下咽癌FaDu细胞后fascin-1沉默或过表达FaDu细胞的转染效率;（2）应用鬼笔环肽染色荧光共聚焦显微镜显影,观察fascin-1沉默或过表达对下咽癌FaDu细胞形态的影响;（3）通过细胞划痕愈合试验和迁移试验,观察fascin-1沉默或过表达对下咽癌FaDu细胞迁移能力的影响;通过侵袭实验,观察fascin-1沉默或过表达对下咽癌FaDu细胞侵袭能力的影响;（4）应用Western blot法检测fascin-1沉默或过表达对E-cadherin、vimentin等EMT发生相关蛋白及MMP-2、MMP-9等侵袭转移相关蛋白表达的影响。实验结果:1、Fascin-1在下咽癌癌组织的阳性表达率明显高于其在癌旁组织的表达,并且两者差异有统计学意义。2、Fascin-1表达与下咽鳞癌的肿瘤TNM分期、颈淋巴结转移明显相关;与患者的性别、年龄、病理分级、肿瘤T分级及术后肺转移无明显相关;Fascin-1表达与下咽鳞癌患者的3年生存率无明显相关。3、在细胞形态学上,与对照组相比,fascin-1沉默组细胞形态近圆形,伴有较少的细胞膜突出物和丝状伪足;与对照组相比,fascin-1过表达组细胞形态有明显极性,呈纺锤体形,伴有较多的细胞膜突出物和丝状伪足。4、在划痕-愈合试验中,与对照组相比,fascin-1沉默组中细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度明显减慢;与对照组相比,fascin-1过表达组中细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度明显增快。在迁移试验中,与对照组相比,fascin-1沉默组中迁移细胞数明显减少,差异有统计学意义;与对照组相比,fascin-1过表达组中迁移细胞数明显增加,差异有统计学意义。在侵袭试验中,与对照组相比,fascin-1沉默组中侵袭细胞数明显减少,差异有统计学意义;与对照组相比,fascin-1过表达组中侵袭细胞数明显增加,差异有统计学意义。5、应用Western blot检测发现,与对照组相比,fascin-1沉默组中MMP-2的表达明显降低,差异有统计学意义;与对照组相比,fascin-1过表达组中MMP-2的表达明显升高,差异有统计学意义;但fascin-1表达变化对MMP-9及与EMT发生相关蛋白E-cadherin、vimentin的表达无影响。实验结论:1、通过对下咽癌组织标本研究表明,fascin-1参与下咽鳞癌的发生、侵袭和转移过程并发挥重要作用;2、通过对fascin-1 siRNA和fascin-1过表达质粒转染后的下咽癌FaDu细胞研究表明,fascin-1可通过改变细胞形态,提高肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,并通过增加肿瘤细胞中MMP-2的表达,进一步促进下咽癌的侵袭和转移。第二部分 缺氧通过HIF-1 α-fascin-1正反馈环路促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究实验目的:缺氧在实体肿瘤微环境中普遍存在,并在肿瘤的侵袭和转移中发挥重要作用。HIF-1α是调控细胞对缺氧反应的重要因子,并参与多种与肿瘤侵袭转移相关的靶基因的调控。Fascin-1是一种球形肌动蛋白交联蛋白,并与肿瘤的侵袭和转移密切相关。文献报道,fascin与HIF-1α在胰腺癌中存在共表达并有明显相关性。因此,本实验主要研究以下几个方面的内容:1、探讨fascin-1与HIF-1α蛋白在下咽鳞癌组织连续切片的表达情况及其表达的相关性;2、应用CoCl2诱导缺氧建立化学缺氧模型,探讨缺氧对下咽癌FaDu细胞迁移和侵袭能力的影响以及缺氧促进下咽癌FaDu细胞侵袭和转移的内在分子机制;3、探讨缺氧对下咽癌FaDu细胞中HIF-1α和fascin-1表达的影响,以及HIF-1 α与fascin-1参与缺氧促进下咽癌FaDu细胞侵袭转移的内在调控机制;4、探讨在下咽癌FaDu细胞中HIF-1α与fascin-1之间的内在调控关系。实验方法:1、以下咽鳞癌组织标本为研究对象,采用免疫组织化学法,检测fascin-1在下咽鳞癌组织连续切片的表达情况及其表达的相关性。2、以下咽癌FaDu细胞为研究对象,首先应用CoCl2诱导化学缺氧,模拟缺氧环境,建立缺氧模型。（1）应用CoCl2诱导缺氧建立化学缺氧模型,通过Western blot法和CCK 8细胞毒性试验筛选合适的CoCl2浓度和CoCl2处理时间;（2）通过划痕-愈合试验、迁移和侵袭试验,研究CoCl2诱导的缺氧对下咽癌FaDu细胞迁移和侵袭能力的影响;通过Westernblot检测CoCl2诱导的缺氧促进下咽癌侵袭和转移的内在机制;（3）应用HIF-1α siRNA沉默HIF-1α表达,通过Westernblot验证缺氧是否通过HIF-1α促进下咽癌的侵袭和转移;应用fascin-1 siRNA沉默fascin-1表达,通过Westernblot验证缺氧是否通过fascin-1促进下咽癌的侵袭和转移;（4）通过HIF-1α沉默或过表达,应用Westernblot检测HIF-1α表达变化对fascin-1表达的影响;通过fascin-1沉默或过表达,应用Westernblot检测fascin-1表达变化对HIF-1α表达的影响。实验结果:1、对下咽鳞癌组织连续切片进行免疫组化染色发现,fascin-1与HIF-1α在下咽鳞癌中存在共表达,并且两者的表达有明显相关性。2、缺氧促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移通过划痕-愈合试验研究发现,与常氧环境相比,在CoCl2诱导的缺氧环境中肿瘤细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度明显加快;在迁移试验中也观察到类似的结果,与常氧环境相比,在CoCl2诱导的缺氧环境中迁移细胞数明显增多,且差异有统计学意义;在侵袭试验中,与常氧环境相比,在CoCl2诱导的缺氧环境中侵袭细胞数明显增多,且差异有统计学意义。通过Western blot检测发现,与常氧环境相比,在CoC12诱导的缺氧环境下,伴随着HIF-1α表达的升高,下咽癌FaDu细胞中MMP-2表达明显升高。3、缺氧上调下咽癌FaDu细胞中HIF-1α和fascin-1的表达通过Western blot检测发现,与常氧环境相比,在CoC12诱导的缺氧环境下,伴随着HIF-1α表达的升高,下咽癌FaDu细胞中fascin-1表达也明显升高。4、缺氧通过HIF-1α促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移通过划痕-愈合试验研究发现,HIF-1 α沉默可抑制在缺氧环境下细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度;在迁移试验中也观察到类似的结果,HIF-1α沉默可减少缺氧环境下的迁移细胞数,且差异有统计学意义;通过侵袭试验研究发现,HIF-1α沉默可减少缺氧环境下的侵袭细胞数,且差异有统计学意义。通过Western blot检测发现,在CoCl2诱导的缺氧环境下,HIF-1α沉默可降低下咽癌FaDu细胞中MMP-2的表达。5、缺氧通过fascin-1促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移通过划痕-愈合试验研究发现,fascin-1沉默可抑制缺氧环境下细胞向无细胞的划痕区域迁移的速度;在迁移试验中也观察到类似的结果,fascin-1沉默可减少缺氧环境下的迁移细胞数,且差异有统计学意义;通过侵袭试验研究发现,fascin-1沉默可减少缺氧环境下的侵袭细胞数,且差异有统计学意义。通过Western blot检测发现,在CoCl2诱导的缺氧环境下,fascin-1沉默后可下调MMP-2的表达。6、在下咽癌FaDu细胞中,HIF-1 α和fascin-1存在相互调控关系通过Western blot检测发现,在缺氧环境下,HIF-1 α沉默可明显降低下咽癌FaDu细胞中fascin-1的表达;在常氧环境下,HIF-1 α过表达可明显上调下咽癌FaDu细胞中fascin-1的表达;同样,在常氧和缺氧环境下,fascin-1沉默可明显降低下咽癌FaDu细胞中HIF-1α的表达;在常氧环境下,fascin-1过表达可明显上调下咽癌FaDu细胞中HIF-1α的表达。实验结论:1、HIF-1α和fascin-1在下咽鳞癌组织中表达明显相关,HIF-1α可能参与fascin-1在下咽鳞癌组织中的高表达。2、缺氧可促进下咽癌FaDu细胞的迁移和侵袭;3、缺氧可上调下咽癌FaDu细胞中HIF-1α和fascin-1的表达并通过HIF-1α或fascin-1促进下咽癌FaDu细胞的迁移和侵袭;4、在下咽癌FaDu细胞侵袭转移中,HIF-1α和fascin-1之间存在相互的正向调控关系;5、缺氧通过HIF-1α-fascin-1正反馈环路促进下咽癌FaDu细胞的侵袭和转移,HIF-1α-fascin-1环路有可能成为下咽癌治疗的新靶点。
赵成岭[7]（2019）在《缺氧条件下人脐带间充质干细胞（hUCMSCS）对肺腺癌A549细胞增殖的影响及机制研究》文中研究指明每年全世界有180万人被诊断为肺癌,160万人因这种疾病死亡[1]。在中国,尽管肺癌的5年生存率有所上升,但仍然不足20%[2-4]。虽然近年来肺癌的早期诊断率有所增高,但仍有相当大部分肺癌患者发现时已是晚期,因此必须要探索新的治疗方案。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSCs）广泛存在于已分化组织中,是中胚层发育的早期未分化细胞,具有多项分化潜能和较强的增殖能力。在炎症过程中,受损的器官组织可以分泌相关趋化因子促进MSCs向损伤部位迁移,并诱导其分化参与组织修复。肿瘤组织代谢比较旺盛,局部也发生炎症反应,其炎症过程和组织损伤导致的炎症相似。肿瘤和其所处的微环境中的多种生长因子、炎性细胞因子、趋化因子等可诱导MSCs归巢[5,6]。最初,人们认为MSCs发挥其作用是通过局部植入和分化成各种细胞类型的能力,随后替代受损组织。然而近年来研究结果提示大多数植入的MSCs无法在受损的组织中存活,MSCs治疗机制可能归因于其分泌的大量生物活性分子,[7]。由于其迁移能力和归巢肿瘤的特点,MSCs已经被设计为肿瘤细胞的特异性靶向提供抗癌剂,从而提供了一种新的细胞介导基因治疗选择[8]。目前,在包括肺癌的不同肿瘤中观察到了抗肿瘤能力[9-13],MSCs已成为癌症治疗的潜在工具。然而相关研究也发现MSCs与癌症进展有关,因而MSCs对肿瘤的发生发展作用一直存在争论。有研究显示迁移至肿瘤内的MSCs能够促进肿瘤的生长和迁移[14,15];人骨髓来源MSCs能够促进胰腺癌细胞的生长[16],人脂肪干细胞可以通过分泌蛋白诱导乳腺癌细胞的转移[17].还有研究提示同一来源的MSCs对不同的肿瘤其作用不同,比如人脂肪来源的MSCs可抑制A549细胞移植瘤生长,却能促进结直肠癌HT-29细胞移植瘤的生长[18]。以上研究结果说明MSCs对肿瘤增殖作用不仅与其来源有关,还与肿瘤的类型有关。李林等[19]研究发现骨髓来源的MSCs在体外抑制A549细胞增殖,在体内则促进A549移植瘤生长。此研究表明了同一来源的MSCs在不同的环境下对同一种肿瘤细胞的作用也可能有所不同。因此探讨MSCs在不同环境下对肿瘤不同作用的机制,从而将MSCs更安全的用于肿瘤治疗具有十分重要的意义。细胞对缺氧或低氧水平的反应是由被称为缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor,HIF）的转录因子驱动的进化保守程序。肿瘤细胞在缺氧状态下可通过缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor,HIF-1α）激活促进糖原代谢的酶或血管生成而促进肿瘤增殖[20]。缺氧是实体瘤的一个重要特点,但常规体外培养肿瘤细胞不能体现出体内实体肿瘤缺氧微环境状态。因此,我们推测,MSCs在体内外对肺腺癌A549细胞增殖的作用相反,与体内外的缺氧微环境差异有关。胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor,IGF）的结构与胰岛素类似,因而得名。IGF-1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）是多功能细胞增殖调控因子,动物体内几乎所有器官的生长和功能都与它有关。IGF-1可促进机体的蛋白质和核酸DNA的合成以及碳水化合物的代谢,在受体和结合蛋白的介导下,通过多种方式（包括自分泌、旁分泌和内分泌等）作用于靶器官,促进细胞的生长和分化。在肿瘤细胞的增殖过程中,肿瘤细胞能够合成IGF-1,通过IGF-1/IGF-1R回路刺激自我增殖[21];在肿瘤的浸润和转移过程中中,IGF-1/IGF-1R能上调血管内皮生长因子表达增加[22]。研究表明,肺癌细胞HIF-1α的表达调控因素不仅是缺氧,还包含其他非缺氧因素,例如肿瘤抑制基因p53,pVHL和PTEN,病毒癌基因如EBV和HPV-16,IGF-1[23-25]等。因此,作为HIF-1α上游调控信号的IGF-1,在缺氧条件下MSCs促进A549细胞增殖过程中可能也发挥了调控作用。miRNA是一类由21～25个核苷酸构成的非编码RNA,其功能是在转录水平上抑制基因表达,由约70核苷酸大小的可形成发夹结构的前体加工而来,一般来源于细胞染色体的非编码区域。研究表明miRNA具有表达的特异性,能够区分组织来源,其表达或结构异常与肿瘤发生密切相关,涉及肿瘤的增殖、浸润、转移、分期及预后等[26,27[。因此miRNA在肿瘤组织中的异常表达具有辅助诊断及开发靶向治疗药物的潜力。本实验通过建立体外hUCMSCs与A549细胞非接触共培养模型及A549细胞移植瘤模型,探讨缺氧条件下HIF-1α和IGF-1在hUCMSCs对A549细胞增殖的影响及分子机制。同时应用Exiqon miRNA寡核苷酸芯片检测hUCMSCs对A549细胞miRNA表达谱的影响,然后应用生物信息学分析差异表达的miRNA生物学功能及其与IGF-1和HIF-1α的关系,为进一步探索hUCMSCs促进A549细胞增殖的机制及寻找有效的靶基因治疗肺癌提供前期理论基础。第一部分 缺氧条件下HIF-1α在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用及机制[目的]观察缺氧条件下及体内hUCMSCs对A549细胞增殖的影响,并探讨缺氧条件下HIF-1α在hUCMSCs促进A549细胞增殖中的机制。[方法]1.建立A549细胞和hUCMSCs的非接触共培养模型。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,采用MTT实验、细胞划痕试验和流式细胞术分别检测缺氧条件下hUCMSCs对A549细胞增殖、迁移及凋亡的影响。qPCR和western blot检测 A549 细胞 HIF-1α、survivin、Bcl-2、Caspase3、JAK1、JAK2 和 STAT3基因及蛋白表达情况。2.建立hUCMSCs与A549细胞共注射移植瘤模型。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,观察hUCMSCs对A549细胞移植瘤生长的影响,并检测HIF-1α、survivin、Bcl-2、Caspase3、JAK1、JAK2、STAT3 基因及蛋白表达水平。[结果]1.在培养72h后,常氧培养条件下hUCMSCs抑制A549细胞增殖（P<0.01）和迁移（P<0.05）。与常氧条件下相比,缺氧条件下A549细胞增殖能力及迁移能力均增强（P均<0.01）,与hUCMSCs共培养进一步增强其增殖能力和迁移能力（P均<0.01）。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,缺氧条件下A549细胞增殖的能力和迁移能力明显下降（P均<0.01）,与hUCMSCs共培养后A549细胞增殖能力和迁移能力并未恢复（P>均0.05）。2.在培养72h后,常氧培养条件下与hUCMSC共培养组A549细胞凋亡率较单独A549细胞培养组上升（P<0.01）;与常氧条件下相比,缺氧条件下A549细胞凋亡率下降（P<0.01）。与hUCMSCs共培养后,A549细胞的凋亡水平进一步下降;干扰A549细胞HIF-1α表达后,A549细胞凋亡率明显增加（P<0.01）;,与hUCMSCs共培养后A549细胞凋亡率无明显变化（^>0.05）。3.与常氧条件下相比,缺氧条件下A549细胞内HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白表达水平均增高（P<0.01）,Caspase3基因及蛋白水平下调（P<0.01）。与hUCMSCs共培养进一步促进A549细胞内HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白表达水平上调及Caspase3基因及蛋白表达水平下调。缺氧条件下干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,A549细胞内HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3 基因及蛋白水平均下调（P<0.01）,Caspase3基因及蛋白水平均上调（P<0.01）,与hUCMSCs共培养后对A549细胞内这些基因及蛋白表达水平均无明显变化（P>0.05）。4.在体内,hUCMSCs促进A549细胞移植瘤的增长,HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白水平均增高（P<0.01）,Caspase3基因及蛋白水平下调（P均<0.01）。干扰A549细胞HIF-1α基因表达后,A549细胞移植瘤生长受到抑制,移植瘤组织中HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK2、STAT3基因及蛋白水平均下降（P<0.01）,Caspase3基因及蛋白水平上调（P<0.01）,并且hUCMSCs不能恢复A549细胞移植瘤的生长能力及上述基因的表达水平。[结论]1.体外常氧培养条件下,hUCMSCs抑制A549细胞增殖和迁移,而体外缺氧条件下或在体内,hUCMSCs均促进A549细胞增殖。2.缺氧条件下或在体内,hUCMSCs通过上调A549细胞HIF-1α、survivin、Bcl-2、JAK1、JAK、STAT3基因及蛋白水平表达上调,下调Caspase3基因及蛋白表达,从而促进A549细胞增殖和迁移,抑制凋亡。其中HIF-1α表达上调起到了重要作用。第二部分缺氧条件下IGF-1在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用及机制[目的]探讨IGF-1在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用机制及缺氧条件下 hUCMSCs 对 A549 细胞上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）的影响。[方法]1.建立hUCMSCs与A549细胞非接触共培养模型和裸鼠A549细胞移植瘤模型,qPCR及westem blot检测缺氧条件下A549细胞及体内A549细胞移植瘤中IGF-1表达水平。2.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,检测缺氧条件下hUCMSCs对A549细胞增殖、迁移及凋亡的影响。3.qRT-PCR及western blot检测A549细胞及移植瘤IGF-1、Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK/STAT3、Caspase3基因及蛋白的表达水平。4.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,观察A549细胞移植瘤生长情况,并检测移植瘤中上皮间充质转化相关基因E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、vimentin、Twist表达水平。[结果]1.体外常氧条件下,相比单独A549细胞培养组,与hUCMSCs共培养组A549细胞内IGF-1表达下调;,而在缺氧条件下,与hUCMSCs共培养组A549细胞内IGF-1表达上调。2.体外缺氧条件下,干扰A549细胞IGF-1基因表达后,A549细胞增殖能力及迁移能力均下降（P均<0.01）,Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、JAK2、STAT3表达水平均下调（P均<0.01）,Caspase 3表达水平上调（P<0.01）。干扰A549细胞IGF-1基因表达后,缺氧条件下与hUCMSCs共培养组A549细胞Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、STAT3 和 Caspase3 表达水平有一定程度恢复。3.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,缺氧条件下A549细胞凋亡率明显上升（P<0.01）;与hUCMSCs共培养后其凋亡率无明显变化（P>0.05）。4.干扰A549细胞IGF-1基因表达后,A549细胞移植瘤的生长受到抑制,肿瘤组织中 Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、JAK2、STAT3 表达水平均下调（P<0.01）,Caspase3表达水平上调（P均<0.01）。干扰A549细胞IGF-1表达后,hUCMSCs能部分恢复 Bcl-2、HIF-1α、survivin、JAK1、JAK2、STAT3 和 Caspase3 表达水平。5.缺氧条件下或在体内,hUCMSCs促使A549细胞EMT相关基因β-catenin、N-cadherin、vimentin、Twist 表达增加（P<0.01）,E-cadherin 表达降低（在体内蛋白水平,P<0.05;余P均<0.01;）。干扰A549细胞IGF-1基因表达后,A549细胞移植瘤β-catenin、N-cadherin、vimentin、Twist 表达下调（P<0.01）,E-cadherin表达上调（P<0.01）。[结论]1.体外缺氧条件下或在体内,hUCMSCs通过促进A549细胞内IGF-1表达,上调HIF-1α表达,促进A549细胞增殖。2.体内hUCMSCs诱导A549细胞发生EMT,其机制与IGF-1表达上调有关。第三部分在体内hUCMSCs对肺腺癌A549细胞microRNA表达谱的影响及生物信息学分析[目的]探讨体内hUMSsC对A549细胞miRNA表达谱的影响,通过生物信息学分析其表达特征。[方法]1.采用Exiqon miRNA芯片检测3对hUCMSCs+A549共注射组移植瘤中A549细胞及其配对A549细胞移植瘤中miRNA差异表达情况,按照表达差异倍数和差异表达显着性（P≤0.01）分别选取前10个上调和下调差异表达的miRNA应用qPCR技术验证。2.利用DAVID数据库提供的基因功能注释工具（GO及KEGG pathways富集分析）对差异表达上调和下调的miRNA进行基因功能和调控通路分析。统计分析HMDD中与肺癌相关的miRNA与mirDB中与IGF-1或HIF-1α基因相关的miRNA,然后再和芯片结果去交集分析,找出与IGF-1或HIF-1α及肺癌相关的miRNA。[结果]1.hUCMSCs共注射组移植瘤A549细胞较单独注射组A549细胞间出现不同程度差异表达的miRNA有337个,其中表达上调的基因数目为154个,显着上调的miRNA数量为63个（差异倍数>2,P<0.05）;下调的基因数目为183个,其中显着下调的基因数量为108个（差异倍数>2,P<0.05）。2.qPCR验证结果显示,在表达差异前20个基因中,表达上调的有12个,下调的有7个,而表达无差异的1个,miRNA芯片检测结果与qPCR检测的结果符合率为70%。3.生物信息学分析结果表明,表达差异的miRNA异常表达可能与DNA转录、基因表达、细胞凋亡、细胞周期等调控异常有关,涉及癌症相关microRNA、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、多功能干细胞信号通路调节、ErbB信号通路等。与肺癌相关的miRNA为6个,与HIF-1α相关的miRNA有9个,与IGF-1相关的miRNA有19个,其中与肺癌和IGF-1均相关的miRNA为miR-1827。[结论]1.体内hUCMSCs使A549细胞内部分miRNA表达出现变化。2.差异表达的miRNA与A549细胞增殖、凋亡及信号通路有关,HIF-1α和IGF-1是部分miRNA潜在靶基因。全文总结我们通过构建体外非接触共培养模型,发现在常氧培养条件下hUCMSCs抑制A549细胞增殖,而在缺氧条件下hUCMSCs促进A549细胞增殖,并发现能促进A549细胞内HIF-1α表达水平增加。通过干扰A549细胞内HIF-1α基因表达后,发现缺氧条件下hUCMSCs促进A549细胞增殖能力下降,体内动物实验同样验证以上结果,因此缺氧微环境是引起hUCMSCs在体内外对A549细胞增殖作用不同的原因。另外我们发现缺氧条件下或在体内hUCMSCs促进A549细胞发生EMT。在分子机制方面,本研究证实缺氧环境下hUCMSCs促进A549细胞内HIF-1α、Bcl-2和survivin表达水平增加,Caspase3表达下降,STAT3通路激活,从而促进细胞增殖。进一步研究发现,缺氧条件下或体内hUCMSCs促进A549细胞内IGF-1表达上调,干扰A549细胞内IGF-1基因表达后,A549细胞增殖能力下降,A549细胞HIF-1α表达下调,说明IGF-1调控了 HIF-1α的表达。本研究同时发现,干扰IGF-1基因表达后,A549细胞Bcl-2和survivin表达下调,Caspase3表达上调,JAK/STAT3通路被抑制。另外,干扰IGF-1基因表达后,hUCMSCs诱导A549细胞发生EMT的作用消失。通过miRNA芯片及生物信息学分析发现,体内hUCMSCs调控了 A549细胞内部分miRNA的表达,通过生物信息学分析发现这些差异表达的miRNA与细胞增殖、凋亡及信号通路有关,HIF-1α和IGF-1可能是miRNA潜在靶基因。本研究证实了缺氧微环境是造成hUCMSCs在体内外A549细胞增殖能力差异的原因,并进一步揭示了缺氧微环境下hUCMSCs通过上调A549细胞内IGF-1表达促进A549细胞增殖并诱导EMT发生的分子机制,并发现hUCMSCs在体内调控A549细胞的部分miRNA表达发生变化,通过生物信息学分析发现与IGF-1和HIF-1α相关的表达差异的miRNA,为hUCMSCs治疗肺癌寻找新的有效的靶基因提供前期理论基础。
杨能力[8]（2018）在《丙泊酚抑制脂多糖诱导的非小细胞肺癌恶性转化作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分:缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-l,HIF1）α亚基的表达水平与非小细胞肺癌预后的相关性研究研究目的:明确HIF-lα的表达水平与非小细胞肺癌病例的淋巴结转移、分化状态、TNM分期等临床特征及预后的关系。研究方法:1.利用Oncomine在线分析软件比较TCGA数据库中Wachi lung肺鳞癌数据集和Stearman lung肺腺癌数据集中癌组织和癌旁组织的HIF-lα mRNA 水平。2.利用免疫组织化学法检测187例非小细胞肺癌组织样本中HIF-lα的表达水平。3.利用Kaplan-Meier法对具有不同HIF-lα表达水平的非小细胞肺癌患者的预后进行差异分析。4.结合187例非小细胞肺癌病例的临床资料,探究HIF-lα的表达水平与非小细胞肺癌淋巴结转移、分化状态、TNM分期等临床特征的关系。研究结果:1.在Wachi lung和Stearman lung数据集中,肺鳞癌和腺癌组织内HIF-1α mRNA水平明显高于正常肺组织。2.HIF-1α高表达的非小细胞肺癌患者五年总生存期显着低于HIF-1α低表达的患者（18.28%vs 34.04%;P=0.0001）。3.HIF-lα的表达水平与非小细胞肺癌的肿瘤大小,淋巴结转移,分化状态以及TNM分期存在关联。结论:相较于癌旁正常组织,HIF-1α的表达水平在非小细胞肺癌组织中显着升高。而高表达的HIF-1α与非小细胞肺癌的恶性临床特征以及较差的预后存在关联。第二部分:丙泊酚抑制脂多糖（LPS）诱导的非小细胞肺癌细胞HIF-1α表达上调的研究研究目的:探究LPS和丙泊酚对非小细胞肺癌细胞中HIF-1α表达的影响。研究方法:1.不同浓度的LPS（0、1、5、10 μ g/ml）与非小细胞肺癌A549细胞共培养,利用荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测细胞内HIF-1 α mRNA的表达水平;免疫印迹法（Western blot）检测细胞内HIF-1 α蛋白的表达水平;化学发光定量法检测细胞内氧自由基ROS水平。2.A549细胞在10 μg/ml LPS培养条件下,用不同浓度的丙泊酚（0、5、10、20 μ g/ml）处理细胞,利用qRT-PCR检测细胞内HIF-1α mRNA的表达水平;Western blot检测细胞内HIF-1 α蛋白的表达水平;化学发光定量法检测细胞内氧自由基ROS水平。3.将A549细胞分为对照组,LPS组（10μ g/ml）及丙泊酚组（10 μ g/ml LPS+20 μ g/ml丙泊酚）处理A549细胞12小时后,分别采用环己酰亚胺追踪实验（CHX-Chase assay）检测细胞内HIF-1 α的蛋白稳定性;免疫荧光实验（IF）检测HIF-1α蛋白的亚细胞定位;报告基因实验（reporter assay）检测细胞内HIF-1的转录活性。研究结果:1.LPS诱导非小细胞肺癌A549细胞中HIF-1α的表达上调及氧自由基的产生（ROS）。2.丙泊酚抑制LPS诱导的HIF-1α表达及氧自由基的产生（ROS）。3.丙泊酚下调LPS诱导的HIF-1α蛋白稳定性及核聚集,抑制HIF-1α的转录功能。结论:LPS通过促进非小细胞肺癌细胞中HIF-1α的表达、蛋白稳定性以及入核,增强HIF-1的转录活性。而丙泊酚能够抑制LPS对HIF-1α的激活作用。第三部分:miR-199a-5p在丙泊酚抑制LPS诱导非小细胞肺癌HIF-1 a表达中的作用研究研究目的:探究丙泊酚在LPS诱导非小细胞肺癌HIF-1 α表达中的作用是否受到miR-199的调控及其机制。研究方法:1.利用 targetscan,BiBiserv2 软件预测 HIF-1α 基因 mRNA 3’UTR上可能的miR-199结合位点。2.利用荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测细胞内HIF-lαmRNA和miR-199a/b-5p的表达水平。3.利用免疫印迹法（Western blot）检测细胞内HIF-1α蛋白的表达水平。4.报告基因实验（reporter assay）检测miR-199a-5p对HIF-1α mRNA的调控作用。5.亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite genomic sequencing）检测miR-199a启动子CpG岛的甲基化水平。研究结果:1.在A549细胞中,miR-199a-5p通过直接靶向HIF-1α mRNA 3’UTR抑制HIF-1α的表达。2.LPS诱导A549细胞中miR-199a-5p的表达下调,从而促进了HIF-1α的表达;而丙泊酚解除了 LPS对miR-199a-5p表达的抑制作用,从而降低了HIF-1α的表达。3.LPS处理A549细胞后,miR-199a基因启动子CpG岛的甲基化水平增强;而丙泊酚抑制了 LPS诱导的甲基化。4.使用过氧化氢酶清除LPS诱导的ROS抑制了 miR-199a基因启动子CpG岛的甲基化,从而促进了 miR-199a-5p水平升高。5.在A549细胞中,抑制LPS诱导的miR-199a基因启动子甲基化促进了 miR-199a-5p水平升高,从而抑制了 HIF-1α的表达。结论:丙泊酚通过抑制LPS诱导的miR-199a基因启动子甲基化促进miR-199a-5p水平上调,从而抑制HIF-1α的表达。第四部分:丙泊酚抑制LPS诱导的非小细胞肺癌的上皮间质转化（EMT）的研究研究目的:探究丙泊酚抑制LPS诱导的非小细胞肺癌的上皮间质转化（EMT）的影响。研究方法:采用LPS（10ng/ml）或LPS（10μg/ml）联合丙泊酚（20μg/ml）处理A549细胞。1.利用荧光定量PCR法（qRT-PCR）检测细胞内E-cadherin、Vimentin以及MMP2/9 mRNA的表达水平。2.利用免疫印迹法（Western blot）检测细胞内E-cadherin、Vimentin 以及 MMP2/9 蛋白的表达水平。3.划痕实验（Wound healing assay）检测细胞迁移能力。4.浸润实验（Transwell assay）检测细胞侵袭能力。研究结果:1.LPS引起A549细胞中表皮型标志分子E-cadherin下调及间质型标志分子Vimentin上调,而丙泊酚抑制了 LPS对E-cadherin和Vimentin表达的影响。2.LPS引起A549细胞中基质金属蛋白酶MMP2/9的水平上调,而丙泊酚抑制了 LPS对MMP2/9表达的影响。3.在LPS处理的A549细胞中,敲低HIF-1α抑制了 Vimentin和MMP2/9的表达,同时促进了 E-cadherin的表达。4.LPS促进A549细胞迁移和侵袭能力,而丙泊酚能够抑制LPS对A549细胞恶性表型的促进作用。然而过表达HIF-lα显着削弱了丙泊酚对A549细胞迁移和侵袭的抑制作用。结论:丙泊酚通过下调HIF-1α抑制LPS诱导的非小细胞肺癌EMT过程及恶性表型。
胡耀中[9]（2017）在《HIF-1α特异性胞内抗体的筛选及肿瘤细胞内转录抑制活性的研究》文中进行了进一步梳理肿瘤的诊断和靶向治疗是临床研究所面临的严峻挑战,单克隆抗体的发现和研究为肿瘤的诊断和靶向治疗提供了新的治疗手段。对于肿瘤治疗,单抗药物具有明确的靶向性,具有起效快、疗效好、副作用小等优点。能克服化疗药物不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞、副作用大等缺点。但传统单克隆抗体因其分子量较大,肿瘤组织与血管的渗透与转运受到阻碍,无法作为胞内抗体,或与肿瘤细胞内靶标特异性结合而发挥抗肿瘤作用。此外,因单克隆抗体存在较强的免疫原性,使其在临床应用受到一定程度的限制,这也促进了小型化抗体的研究与发展。新型基因工程抗体,如嵌合抗体、人源化抗体和单域抗体,因其在稳定性、表达产量和抗体亲和力方面的天然缺陷而阻碍了临床的进一步应用。纳米抗体（Nanobodies,Nbs）来源于天然存在于骆驼科动物体内的重链抗体,是目前可以得到的具有完整抗原结合功能的最小抗体分子片段。作为一种小分子抗体片段,纳米抗体具有诸多优点,如较高的组织穿透性,较高的亲和力和水溶性,以及较高的特异性和亲和力。另外由于其小分子特性,使其保持较低的免疫原性,并且易于表达和纯化。因其特殊的物理学和生物学特性,纳米抗体被广泛的应用于肿瘤的诊断与治疗相关的研究。然而,纳米抗体在肿瘤诊断与治疗领域的的研究主要集中于肿瘤胞外靶标,如细胞因子,信号受体以及跨膜蛋白胞外结构域。然而,与肿瘤生长和细胞增殖相关的信号通路与信号传导机制主要发生在细胞内,针对肿瘤胞内抗原的抗体能够更有效的干扰与抑制肿瘤细胞生长与增殖相关的信号通路,从而达到抑制肿瘤生长的目的。此外,针对肿瘤胞内抗原的纳米抗体的开发,也能应用于肿瘤细胞内信号通路的研究从而有助于发现肿瘤发生与生长相关的信号通路和信号因子。因此,肿瘤胞内靶标的研究以及肿瘤胞内抗体的开发对于理解肿瘤的发展和诊断治疗有重要的意义。因肿瘤细胞的快速增殖会消耗大量的氧气,以及肿瘤对周围组织血管的浸润和破坏,从而导致肿瘤细胞中的普遍存在的缺氧状态。肿瘤组织中的乏氧可导致肿瘤细胞侵袭性增强,同时可诱导肿瘤对化放疗产生抗拒。肿瘤细胞的供血、供氧越好,代谢越旺盛,对放射线越敏感;反之,供血、供氧差的细胞对放射线的敏感性较差。肿瘤细胞缺氧会导致乏氧诱导因子-1（HIF-1）的表达水平显着高于正常组织,是肿瘤细胞中一系列基因改变的关键调控因子,起着中枢纽带作用。HIF-1是由氧浓度依赖性调节的HIF-1α亚基和组成性表达的HIF-1β亚基构成的异源二聚体。HIF-1α和β亚基都具有bHLH（basic helix-loop-helix）和PAS（Per-ARNT-Sim）结构,属于bHLH-PAS蛋白超家族。PAS蛋白结构域包括A、B两个亚结构域,是其形成异源二聚体并与DNA结合所必需的结构,是HIF-1发挥转录活性的关键结构域。PAS结构域的删除,甚至在二级结构域的数个氨基酸的突变会导致HIF-1转录活性的显着降低。HIF-1的转录活性主要取决于HIF-1α亚基的表达水平及其活性。在常氧条件下,细胞内HIF-1α极不稳定（半衰期<5 min）,在脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase,PHDs）的作用下,HIF-1αODD区的第402位、第564位的脯氨酸残基被羟基化后可与肿瘤抑制因子（von hippel-lindau,VHL）结合,在肿瘤抑制蛋白（pVHL）协同作用下,经泛素化蛋白酶途径而发生降解。在乏氧条件下,HIF-1α因不能被正常羟基化而不能与pVHL结合而发生降解,使细胞内HIF-1α水平显着增加。HIF-1α与β亚基的二聚化形成具有转录活性的HIF-1因子,从而促进靶向基因的转录激活。迄今为止已经发现的HIF-1相关的靶向基因超过100多种,这些基因的启动子或增强子内含有一个或多个具有5’-TACGTG-3’核苷酸序列的缺氧反应元件（hypoxia response elements,HREs）,HIF-1通过与HREs的结合而启动下游靶向基因的转录作用。这些基因表达后参与,如红细胞生成,血管形成,核苷、氨基酸、糖的能量代谢,细胞存活、凋亡和活动以及药物抵抗等生物学效应,以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境稳定,以适应缺氧。同时HIF-1及其诱导表达的基因还在生理性缺氧如干细胞微环境、胎盘发育、胚胎发育过程中组织细胞分化,以及多种病理情况如肿瘤的发展、转移中发挥着重要作用。低氧状态下,肿瘤细胞对化疗药物的耐药指数是常氧状态下的数倍,HIF-1的转录活性与多种耐药性相关的蛋白的表达相关,从而降低传统治疗手段的抗肿瘤作用。HIF-1的活性与血管生成相关,也造成肿瘤的发生及恶化。当细胞乏氧时,HIF-1能够促进血管内皮生长因子（VEGF）的转录并增加VEGF mRNA的稳定性,从而增加VEGF的表达。高浓度的VEGF可通过PI3K、MAPK、Ras、PLC等信号传导途径促进肿瘤血管内皮细胞生长,使肿瘤血管生成增加,促进肿瘤细胞的生长和增殖。HIF-1靶基因编码的蛋白中包含诸多与糖酵解及葡萄糖代谢相关的酶,肿瘤细胞处于乏氧条件下,HIF-1可以转录激活与糖酵解作用相关的代谢酶,增加肿瘤细胞摄取及利用葡萄糖代谢的能力,保证了肿瘤细胞生长的能量需求。肿瘤的侵袭和转移与多种酶类和细胞因子的表达及活性有关。HIF-1α可通过诱导多种蛋白酶及细胞因子,如基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases,MMP）、尿激酶受体（urokinase receptor）,上皮型钙粘素（epithelial cadherin,E-cad）与β-链接素（β-catenin）,使细胞与基质间之间、细胞与细胞之间的粘附性降低,导致细胞分离、侵袭及其转移。此外,乏氧条件下肿瘤的侵袭转移还与肿瘤细胞趋化因子受体CXCR4有关。HIF-1α可使CXCR4水平增加,不仅促进肿瘤细胞的转移,而且使其定位于特定器官。通过抑制HIF-1α而达到抑制肿瘤生长的作用机理大体上可以分为阻断相关信号转导通路和抑制HIF-1α的表达活性两类。本课题选择HIF-1α亚基的PAS B结构域蛋白为靶向抗原,旨在通过筛选针对PAS B结构域的特异性纳米抗体,并表达为胞内抗体,以期干扰HIF-1α与β亚基的结合,从而降低胞内HIF-1的水平,从而降低HIF-1相关靶基因的转录水平,以达到抑制HIF-1的转录活性的目的。本研究构建了纳米抗体免疫库,并设计与构建了特异性针对胞内抗原靶标（RNA,蛋白质等）的合成库,通过噬菌体展示技术富集筛选了抗原特异性纳米抗体,并对纳米抗体的物理学和生物学性质进行了评价。首先,表达和纯化了重组PAS B结构蛋白rPasB。基于PAS B蛋白的基因序列,并针对大肠杆菌表达载体的密码子偏好进行了密码子优化,然后进行基因序列的人工合成。之后将人工合成的基因克隆入pET21b载体构建了重组表达载体,并将其转化进入BL21（DE3）大肠杆菌表达细胞进行重组蛋白的表达。通过设立不同诱导时间,不同诱导温度及不同IPTG诱导浓度的实验组确定重组蛋白的最优表达条件。rPasB蛋白在BL21（DE3）胞内表达,通过超声细胞破碎将重组蛋白释放。镍离子金属亲和层析色谱用于从裂解液中纯化rPasB蛋白,尺寸排阻色谱用于去除rPasB中的游离咪唑并去除潜在的杂蛋白。rPasB的纯度与正确表达通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹实验进行确证。圆二色谱用于确认rPasB蛋白的二级结构及其热稳定性。纯化得到的rPasB蛋白用于免疫单峰驼。100μg rPasB蛋白通过静脉注射进入单峰驼体内以产生免疫反应,为引起足够的免疫反应免疫注射进行六周,免疫周期结束后收集血液并提取淋巴细胞。总RNA从淋巴细胞中提取并用作模板进行反转录PCR以获得cDNA,在接下来的PCR中以cDNA为模板,以特定引物进行PCR以获得包含重链抗体单域结构的基因集合。将所得到的基因集合通过酶切连接克隆至pMECS噬菌粒载体以构建纳米抗体表达载体,重组载体通过电转化进入TG1细胞构建了纳米抗体免疫库。本研究基于针对胞内抗原的纳米抗体的序列分析,基于纳米抗体BCII10的读码框结构设计了针对胞内抗原的人工合成库。抗体序列通过特定氨基酸的随机合成来制备纳米抗体基因集合。通过酶切连接进入pMECS噬菌粒载体以构建纳米抗体表达载体,重组载体通过电转化进入TG1细胞构建了纳米抗体合成库。免疫库及人工合成库的容量及多样性通过克隆PCR及序列测定进行了确证。通过随机挑取单克隆进行克隆PCR来确定抗体库中正确插入序列的比例。通过序列测定来分析合成库中特定氨基酸的分布并与设计时确认的比例进行比较来确认抗体库的质量。本研究证实了大容量免疫库与合成库的制备,免疫库及合成库的多样性进行了确认。基于纳米抗体免疫库及合成库的成功构建,以rPasB重组蛋白为抗原进行了特异性纳米抗体的富集筛选。通过四轮富集筛选,获得了针对rPasB蛋白的特异性纳米抗体。经过序列分析和酶联免疫吸附实验,确证了特异性纳米抗体的DNA序列和抗原结合能力。从TG1细胞中提取包含特异性纳米抗体DNA序列的pMECS噬菌粒载体,并转化进入大肠杆菌WK6细胞中用于纳米抗体的表达。特异性纳米抗体在WK6细胞周质空间表达,通过渗透压休克提取包含纳米抗体的提取液。镍离子金属亲和层析色谱用于从提取液中纯化抗体蛋白,尺寸排阻色谱用于去除抗体中的游离咪唑并去除潜在的杂蛋白,纳米抗体的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹实验进行确证。纯化的纳米抗体与rPasB蛋白的结合通过Western blot和ELISA进行了验证。本研究基于HeLa细胞构建了乏氧诱导模型,对特异性纳米抗体与HeLa细胞内天然HIF-1α蛋白的结合活性进行验证。去铁胺（Deferoxamine,DFO）及氯化钴（CoCl2）能够在常氧状态下通过不同机理干扰HIF-1α蛋白的氧依赖降解,从而升高细胞内HIF-1α水平。DFO是一种铁离子螯合剂,主要与三价铁离子络合形成复合物。由于其螯合的特性,无论是游离的或者铁蛋白结合的铁离子均能与之络合,形成铁胺复合物。因此,DFO通过与铁离子络合而影响与HIF-1α蛋白降解相关的脯氨酰羟化酶的活性,从而抑制HIF-1α蛋白在常氧条件下的降解。CoCl2通过多种机理来抑制HIF-1α蛋白在常氧条件下的降解。首先,CoCl2能够与HIF-1α蛋白降解相关的脯氨酰羟化酶结合,影响其对HIF-1α蛋白的羟基化而抑制常氧状态下的降解,升高胞内HIF-1α水平;其次,CoCl2还能够与已经羟基化的HIF-1α蛋白结合,从而干扰羟基化HIF-1α蛋白与pVHL的结合而抑制HIF-1α蛋白的降解。本研究对不同浓度的DFO及CoCl2的蛋白降解抑制作用进行研究,分别用0.1和0.2 mM的DFO及0.2和0.3 mM的CoCl2诱导HeLa细胞,收集诱导的细胞并冻融提取裂解液,通过Western blot检测诱导后细胞中HIF-1α蛋白的水平,不同条件下HIF-1α蛋白的水平通过Flow cytometry进行确证,并确定最优的诱导条件为0.3 mM CoCl2。筛选的特异性纳米抗体与天然HIF-1α蛋白的结合通过免疫共沉淀（Immunoprecipitation,IP）及Flow cytometry进行研究。0.3 mM CoCl2过夜诱导HeLa细胞并通过冻融收集细胞裂解液,特异性纳米抗体与裂解液孵育以俘获裂解液中天然HIF-1α蛋白,Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体与鼠抗-HA标签单抗结合以捕获Nb-HIF-1α复合物,通过Western blot以检测筛选的抗体是否可以特异性的俘获天然HIF-1α蛋白。特异性纳米抗体与HIF-1α蛋白的结合通过Flow cytometry进行了验证,并与IP结果相符。基于成功筛选的能够与天然HIF-1α蛋白结合的特异性纳米抗体,构建了能够稳定表达胞内抗体的HeLa细胞株,并对胞内抗体的表达与结合活性进行研究。基于乏氧诱导模型,通过实时定量PCR对特异性纳米抗体的转录抑制活性进行了研究。在筛选的能够与天然HIF-1α蛋白结合的纳米抗体中选择sNb44及Nb747,基于哺乳动物细胞表达质粒pCI-neo构建了胞内抗体表达载体Ib-sNb44及Ib-Nb747。针对大肠杆菌SlyD蛋白的Nb3用作构建胞内表达载体Ib-IRNb3,并作为阴性对照以研究胞内抗体的转录抑制活性。将构建的胞内表达载体转染进入对数生长期的HeLa细胞,G-418用以筛选能够稳定表达胞内抗体的HeLa细胞株。当稳定生长的细胞汇合度达到60%的时候,收集细胞并扩大培养,以获得足够的细胞。胞内抗体的表达通过Western blot进行验证,稳定生长的HeLa细胞通过冻融提取细胞裂解液,并用鼠抗-His标签单抗检测裂解液中胞内抗体的表达。Ni2+藕合的磁珠用以将裂解液中的胞内抗体纯化,并用纯化的胞内抗体进行IP,以验证胞内抗体对天然HIF-1α蛋白的结合活性。Western blot验证了胞内抗体的成功表达,IP实验证实了胞内抗体的结合活性。本研究对胞内抗体的转录抑制活性进行了研究,胞内抗体的转录抑制活性通过实时定量HIF-1相关的靶向基因的表达水平来进行验证。本课题选择了HIF-1相关的靶基因BNIP3,CA9,GAPDH与PGK1作为目标基因与评价指标,B2M,GUSB与ACTB用作内参基因,设计了qRT-PCR所需引物并对引物质量进行验证。基于乏氧诱导模型,构建了用于评价转录抑制活性的细胞模型。通过0.3 mM CoCl2诱导胞内抗体表达的HeLa细胞株,提取诱导后细胞总RNA并进行qRT-PCR。对诱导后HIF-1相关的靶基因水平进行了定量研究以确证HIF-1α蛋白水平的升高能显着增加靶基因的转录水平。研究结果表明HIF-1α蛋白的胞内水平能显着影响靶基因的转录水平,并将此模型用以评价胞内抗体的转录抑制活性。HIF-1α蛋白的化学抑制剂CAY10585用作阳性对照,本实验证实CAY10585能显着抑制HIF-1α的转录活性,从而降低乏氧诱导模型中HIF-1靶基因的转录水平。从稳定表达胞内抗体的HeLa细胞提取总RNA,并进行qRT-PCR以定量不同实验组中靶基因的转录水平。本课题实验结果证明胞内抗体Ib-sNb44及Ib-Nb747能不同程度的抑制HIF-1的转录活性。本研究筛选了针对E.coli内源性蛋白的特异性纳米抗体。在rPasB蛋白的纯化过程中,E.coli内源性蛋白作为杂蛋白与rPasB同时纯化出来,并随rPasB蛋白注射进入单峰驼体内产生免疫反应。在后续筛选针对rPasB蛋白的特异性纳米抗体的过程中,筛选得到了针对此E.coli内源性蛋白的纳米抗体。经免疫共沉淀捕获此杂蛋白并用质谱进行了鉴定,鉴定结果显示此杂蛋白为E.coli SlyD蛋白。SlyD蛋白作为潜在的杂蛋白被多次报道,因其氨基酸组成序列中包含近10%的组氨酸,对镍离子亲和柱有很高的亲和力,能够与包含His标签的重组蛋白同时纯化而成为潜在的杂蛋白。尤其当重组蛋白与SlyD蛋白分子量相近时,常用的尺寸排阻色谱将难以去除SlyD蛋白,从而对后续研究产生不利影响。基于筛选得到的针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体Nb5,本课题开发了两套方案用于从rPasB重组蛋白中去除SlyD蛋白。在第一套方案中,基于免疫俘获技术利用Nb5从重组蛋白中捕获并去除E.coli SlyD蛋白,从而制备高纯度重组蛋白。纳米抗体Nb5与重组蛋白孵育以俘获重组蛋白中的SlyD蛋白,从而形成Nb5-SlyD复合物,过量Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体与鼠抗-HA单克隆抗体结合用以捕获重组蛋白中的Nb5-SlyD复合物,沉淀后的上清中即包括纯化的重组蛋白。纯化结果通过SDS-PAGE和Western blot进行验证,结果显示Nb5能够高效去除重组蛋白中的SlyD蛋白从而制备高纯度重组蛋白。在第二套方案中,纳米抗体Nb5进行了生物素标记并去除了C-端His标签,表达了生物素化的Nb5（Bi-Nb5）。过量Bi-Nb5与重组蛋白孵育,以俘获重组蛋白中的SlyD蛋白形成Bi-Nb5::SlyD复合物,显着增加复合物的分子大小。利用尺寸排阻色谱将重组蛋白rPasB与Bi-Nb5::SlyD复合物分离,结果显示rPasB能够与复合物完全分离。分离后的rPasB中含有过量的Bi-Nb5,因Bi-Nb5不含有His标签,可以利用镍离子亲和层析将rPasB纯化。实验结果用SDS-PAGE和Western blot分析,证实Bi-Nb5能够有效用于纯化rPasB中的E.coli SlyD蛋白。在第一套纯化方案中,由于鼠抗-HA单克隆抗体与Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体的成本较高,适用于快速制备小量重组蛋白。相反,第二种方案成本较低,Bi-Nb5能够很容易的制备并大量表达,更适用于大批量制备重组蛋白。另外,Nb5可以表达为二价抗体,从而可以进一步增加复合物的分子大小,有利于分离与E.coli SlyD蛋白分子大小相近的重组蛋白。纳米抗体Nb5可以与固相载体进行共价偶联,从而制备亲和吸附载体用于大批量的重组蛋白制备,如CNBr activated Sepharose or agarose,carboxyl-modified microspheres或latex beads。总而言之,本研究制备了大容量驼源纳米抗体免疫库及针对胞内抗原的合成库,筛选了针对HIF-1α亚基的特异性纳米抗体,并对抗体与HIF-1α蛋白的结合作用进行了研究。构建了特异性纳米抗体的胞内表达载体,并转染进入HeLa细胞,筛选了能够稳定表达胞内抗体的细胞株。胞内抗体的表达及结合活性进行了验证。基于HeLa细胞制备了乏氧诱导模型,并针对HIF-1相关靶基因构建了纳米抗体转录抑制活性的评价模型,并对胞内抗体对HIF-1的转录活性的抑制作用进行了评价。本研究筛选了针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体,并基于纳米抗体Nb5开发了两套方案用于纯化重组蛋白中的E.coli SlyD蛋白。针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体的筛选进一步拓展了纳米抗体在蛋白纯化领域的研究与应用。
陆艳荣[10]（2017）在《HIF-1α通过调控与血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及食管癌细胞放射敏感性的影响研究》文中研究说明目的:本研究拟探讨HIF-1α及其调控的血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及预后的影响;同时探讨其对食管癌Eca109细胞放射敏感性的影响,并观察加用HIF-1α抑制剂2ME2后对食管癌Eca109细胞放射敏感性的影响。方法:1、收集共6例食管癌及癌旁组织标本,使用基因芯片技术检测食管癌（n=3）和癌旁组织（n=3）的m RNA表达,通过在线软件DAVID对差异基因进行基因本体论和信号通路富集分析,从中筛选与血管生成相关的差异表达基因,再通过q RT-PCR验证基因芯片数据。2、采用免疫组化SP法,研究的对象为2011年1月至2015年6月到新疆医科大学附属肿瘤医院接受治疗的70例食管癌患者和30例正常食管组织,检测其VEGF、HIF-1α以及AGGF1的表达,根据随访得到的资料以及临床病例特征进行研究分析。3、模拟食管癌细胞在体内的缺氧环境,在缺氧培养及缺氧合并照射以及2ME2干预情况下,分别用CCK-8观察细胞的增殖活性,RT-PCR方法检测HIF-1α、VEGF和AGGF1 m RNA的转录水平,Western blotting检测HIF-1α、VEGF和AGGF1蛋白表达情况,使用流式细胞仪检测细胞凋亡以及周期的变化规律,并用克隆形成试验观察食管癌细胞的放射敏感性变化。结果:1、与癌旁组织相比:1)食管癌显着差异表达基因共936个,其中上调的差异基因数目为306个,下调的差异基因数目为630个。2)基因本体论分析结果:差异表达基因的基因本体论富分析结果表明,细胞分裂、DNA修复,血管生成、细胞周期、DNA复制等为上调的差异表达基因生物学过程,肌肉收缩、血管收缩调控、信号传导、炎症反应等为下调的差异表达基因涉及的生物学过程。3)信号通路富集分析结果:上调基因Pathway主要富集于DNA复制、血管生成、Fanconi贫血通路、细胞周期等,下调基因Pathway富集于c GMP-PKG信号通路、血管平滑肌收缩、c AMP信号通路、MAPK信号通路等。2、70例食管鳞癌中AGGF1（χ2=8.129,P=0.004）、HIF-1α（χ2=21.212,P=0.000）和VEGF（χ2=4.116,P=0.042）的表达有所不同,从结果来看70位食管鳞癌患者中的AGGF1、HIF-1α、VEGF要明显高于正常食管组织。对于食管鳞患者而言,VEGF、HIF-1α和AGGF1的表达与分化程度、T分期、N分期、临床分期、放疗反应等均密切相关（P均<0.05）。食管鳞癌中的VEGF与AGGF1、HIF-1α的表达均呈现显着正相关,（r=0.333,P=0.003,r=0.290,P=0.015）。放疗近期疗效和VEGF、HIF-1α的表达均呈现显着负相关（r=-0.288、-0.241,P=0.016、0.044）。OS方面,HIF-1α阳性表达组要小于阴性组（P=0.022）。利用Cox多因素回归的方式进行分析,结果发现HIF-1α阳性表达（P=0.000）、浸润深度（P=0.049）和加用化疗（P=0.037）是食管鳞癌患者预后的影响因素。3、随着Co Cl2浓度的增加（0、50、100、150、200μmol/L）,Eca109细胞的增殖活性逐渐减慢（P<0.05）。缺氧可使G0/G1期阻滞,降低S期阻滞。缺氧处理24h及48h组的G0/G1及S期Eca109细胞比例与对照组及缺氧处理6h、12h组差异有统计学意义（P<0.05）。在缺氧状态下放疗+2ME2组中,Eca109存活细胞减少的更为明显,且各组比较差异均有统计学意义（P均<0.05）。2ME2+放疗组细胞凋亡明显多于单纯放疗组（P<0.05）。经过给予0.5m M和1m M的2ME2后,升高的HIF-1α、VEGF和AGGF1的m RNA表达均有所下降（P<0.001）。当缺氧24h时给予2ME2后,升高的HIF-1α、VEGF和AGGF1的蛋白表达均明显下降（P<0.001）。结论:1、1)与癌旁组织相比,一共有936个差异表达基因,上调差异基因和下调差异基因数目分别为306个和630个。2)与食管癌血管生成相关的差异表达基因有:WNT5A,VEGFC,CHRNA7,ANG,ECM1,VEGFA,HOXB13,AGGF1,HIF1A,VEGFB,HEY1,HIF3A,MMP27等,其中HIF3A,MMP27为下调的差异基因,其余均为上调的差异基因。3)部分差异表达基因经过q RT-PCR验证后与基因芯片数据分析结果一致。2、食管鳞癌组织中HIF-1α、AGGF1以及VEGF表达明显高于正常食管组织,且与食管癌临床分期、分化程度等相关,若三者均为高表达,可能不利于食管鳞癌患者的治疗与预后。为以HIF-1α,VEGF及AGGF1为靶点的食管鳞癌的靶向治疗提供新的思路和方法。3、1)Co Cl2诱导Eca109细胞缺氧后,使HIF-1α、VEGF和AGGF1m RNA、蛋白表达将随之增加,蛋白表达量与缺氧呈时间依赖性。2)放疗能够使食管癌Eca109细胞在缺氧条件下HIF-1α、VEGF及AGGF1 m RNA的表达降低。缺氧引起Eca109细胞出现G0/G1期阻滞可能与食管癌Eca109细胞对放射线的敏感性降低有关。3)HIF-1α抑制剂2ME2可在体外提高Eca109细胞放射敏感性。
二、Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α and Its Relationship to Apoptosis and Proliferation in Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α and Its Relationship to Apoptosis and Proliferation in Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma（论文提纲范文）
（1）Cancer metabolism and tumor microenvironment:fostering each other?（论文提纲范文）
| Summary |
| Cancer metabolism and the Warburg effect |
| The origin and understanding of the Warburg effect |
| Metabolic reprogramming beyond“the Warburg effect” |
| Aberrant biosynthesis for cancer cell proliferation |
| Metabolite signaling in cancer development |
| Metabolites regulating epigenetic alterations in cancer cells |
| Metabolites regulate molecules of the central dogma |
| Oncometabolites regulating epigenetic events |
| PGK1 in cancer and multifaceted functions of metabolic enzymes |
| PGK1 mutations and expression in cancers |
| Glycolytic and non-glycolytic functions of PGK1 in cancers |
| Oncogenes and metabolic reprogramming |
| c-Myc and metabolism reprogramming |
| P53 and metabolic reprogramming |
| HIF and metabolic reprogramming |
| Redox deregulation and cancer onset |
| ROS scavenging in cancer cells |
| ox PTMs buffer oxidative stress for cancer cell survival |
| Ox PTMs of redox-sensitive proteins regulate cancer signaling and death |
| Exosome RNA and tumor progression |
| Transmission of materials among cells |
| Exosome RNA bridges cancer cells and stromal cells |
| PMNs regulating organotropic metastasis |
| Origins of PMNs and their cancer linkages |
| CAFs and cancer microenvironment |
| What are CAFs? |
| The heterogeneity of CAFs |
| The role of CAFs in tumor progression |
| T cell metabolism and antitumor immune responses |
| Metabolism and functions of immune cells |
| Treg metabolism and cancers |
| Metabolic products regulating anti-tumor responses |
| ROS |
| OXPHOS metabolites |
| Lactate |
| Glucose |
| Amino acids |
| Lipids and cancer immunity |
| Cholesterol metabolism in T cell-dependent antitumor responses |
| TME regulates T cell functions |
| Future perspectives |
| Targeting cancer cells by interfering with internal environments |
| Targeting cancer cells by altering TMEs |
（2）p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胶质瘤的研究进展 |
| 1.1.1 胶质瘤的发生发展 |
| 1.1.2 胶质瘤的治疗现状 |
| 1.2 肿瘤乏氧微环境的研究现状 |
| 1.2.1 肿瘤乏氧微环境 |
| 1.2.2 乏氧肿瘤的代谢重编程 |
| 1.2.3 乏氧肿瘤的辐射抗性 |
| 1.3 p21在肿瘤放疗中的功能多样性 |
| 1.3.1 p21参与电离辐射应答 |
| 1.3.2 p21与细胞周期 |
| 1.3.3 p21与DNA损伤修复 |
| 1.3.4 p21与细胞凋亡 |
| 1.3.5 p21与其他细胞进程 |
| 1.4 研究目的及章节安排 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备及仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞培养主要试剂及耗材 |
| 2.2.2 细胞转染主要试剂及耗材 |
| 2.2.3 CCK-8 检测细胞增殖主要试剂及耗材 |
| 2.2.4 免疫印迹杂交主要试剂及耗材 |
| 2.2.5 RNA提取、反转录以及Real-time PCR主要试剂及耗材 |
| 2.2.6 EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.7 胞内葡萄糖摄入量的检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.8 培养基中乳酸产量的检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因实验主要试剂及耗材 |
| 2.2.10 构建稳定过表达p21的U87细胞株主要试剂及耗材 |
| 2.2.11 异种移植小鼠模型的构建及相关动物实验主要试剂及耗材 |
| 2.2.12 本研究所用到的小分子抑制剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞乏氧处理 |
| 2.3.3 细胞辐照 |
| 2.3.4 细胞转染 |
| 2.3.5 克隆存活 |
| 2.3.6 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 2.3.7 免疫印迹杂交 |
| 2.3.8 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.9 RNA反转录和Real-time PCR |
| 2.3.10 EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测 |
| 2.3.11 胞内葡萄糖摄入量的检测 |
| 2.3.12 培养基中乳酸含量的测定 |
| 2.3.13 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.14 构建稳定过表达p21的U87细胞株 |
| 2.3.15 异种移植小鼠模型的构建及相关动物实验 |
| 2.3.16 统计学方法 |
| 第3章 胶质瘤乏氧及辐射抗性相关生物标志物的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 乏氧处理增加胶质瘤细胞的辐射抗性 |
| 3.2.2 对待选生物标志进行生物信息学分析 |
| 3.2.3 检测待选生物标志在乏氧条件下的表达情况 |
| 3.2.4 p21对胶质瘤增殖及辐射敏感性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 乏氧条件下p21通过增强糖酵解途径提高胶质瘤细胞的辐射抗性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 乏氧条件下p21对糖酵解途径的影响 |
| 4.2.2 p21通过调控Glut1和LDHA影响糖酵解途径 |
| 4.2.3 乏氧条件下Glut1和LDHA对胶质瘤增殖的影响 |
| 4.2.4 乏氧条件下Glut1和LDHA对胶质瘤辐射敏感性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 p21与HIF-1α间的相互正反馈调节回路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 HIF-1α与p21的表达成正相关 |
| 5.2.2 乏氧条件下HIF-1α直接转录激活p21 |
| 5.2.3 乏氧条件下HIF-1α通过p21上调Glut1和LDHA |
| 5.2.4 乏氧诱导的p21促进HIF-1α的转录 |
| 5.2.5 HIF-1α能够调控Glut1和LDHA的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 体内实验验证HIF-1α/p21信号轴增强胶质瘤辐射抗性 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 稳定过表达p21的U87细胞株的构建 |
| 6.2.2 p21过表达增强胶质瘤的辐射抗性 |
| 6.2.3 过表达p21增强胶质瘤内的糖酵解途径 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 文献综述 STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解的调节作用 |
| 一、STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解调节酶的调控作用 |
| 1. STAT3对HIF-1α的调节作用 |
| 2. STAT3对HIF-2α的调节作用 |
| 二、STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解关键酶的调控作用 |
| 1. STAT3对糖酵解第一阶段关键酶GLUT1的调控作用 |
| 2. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶HK2的调控作用 |
| 3. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶PFK的调控作用 |
| 4. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶PKM2的调控作用 |
| 5. STAT3对糖酵解第三阶段关键酶LDHA的调控作用 |
| 三、STAT3对免疫细胞有氧糖酵解的调控作用 |
| 四、STAT3和糖酵解对肿瘤细胞免疫原性死亡的影响 |
| 五、总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂材料和制剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器设备 |
| 四、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 1.1 干扰STAT3的表达可以抑制肝癌细胞的增殖并促进细胞凋亡 |
| 1.2 干扰STAT3的表达促进calreticulin和ERp57等“eat me”信号分子在肝癌细胞的膜转移 |
| 1.3 干扰STAT3的表达减少“don't eat me”信号分子CD47在肝癌细胞表面的表达 |
| 1.4 干扰STAT3的表达促进肝癌细胞释放ATP |
| 1.5 干扰STAT3的表达增强肝癌细胞对DC的活化作用 |
| 1.6 干扰STAT3的表达增强巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬作用 |
| 2. 靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡的机制研究 |
| 2.1 STAT3通过结合PKR调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化 |
| 2.2 STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制免疫原性死亡 |
| 2.3 STAT3通过调控“don't eat me”信号分子-CD47抑制免疫原性死亡 |
| 3. 抑制小鼠肝癌模型中STAT3信号通路可诱导机体抗肿瘤免疫应答及免疫记忆的产生 |
| 3.1 干扰小鼠肝癌细胞Hepa1-6中STAT3表达可以诱导细胞免疫原性死亡 |
| 3.2 STAT3抑制剂Napabucasin体外诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 3.3 STAT3抑制剂Napabucasin体内诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 3.4 STAT3抑制剂Napabucasin抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的生长并改善肿瘤免疫微环境 |
| 3.5 STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: STAT3抑制剂Napabucasin抑制肝癌干细胞特性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂材料和制剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器设备 |
| 四、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. Napabucasin体外显着抑制肝癌细胞的活力 |
| 2. Napabucasin体外抑制肝癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡 |
| 3. Napabucasin抑制肝癌细胞干性相关分子的表达 |
| 4. Napabucasin抑制肝癌细胞集落形成和成球能力 |
| 5. Napabucasin抑制肝癌干细胞球的细胞活力及干性相关分子的表达 |
| 6. Napabucasin抑制HBV的复制 |
| 7. Napabucasin抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的生长 |
| 8. Napabucasin促进中晚期Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的坏死 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 论文创新性及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 已发表学术论文 |
| 待发表学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（5）骨桥蛋白通过PI3K/AKT通路上调HIF-1α表达促进食管癌放疗抵抗（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: OPN对局部晚期食管鳞癌患者放疗疗效和预后预测价值分析 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分: OPN通过PI3K/AKT诱导HIF-1α高表达促进食管癌放疗抵抗的体外研究 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分: OPN诱导HIF-1α高表达促进食管癌放疗抵抗的体内研究 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 附件Ⅰ |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（6）缺氧通过HIF-1α-fascin-1环路促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 Fascin-1促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 缺氧通过HIF-1α与fascin-1正反馈环路促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文文章 |
（7）缺氧条件下人脐带间充质干细胞（hUCMSCS）对肺腺癌A549细胞增殖的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 缺氧条件下HIF-lα在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用及机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第一部分附图 |
| 附表 |
| 第二部分 缺氧条件下IGF-1在hUCMSCs促进肺腺癌A549细胞增殖中的作用及机制 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 附图 |
| 附表 |
| 第三部分 在体内hUCMSCs对A549细胞miRNA表达谱的影响及生物信息学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表文章和主持参与的科研课题 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 综述 间充质干细胞在肺癌治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 外文论文 第一篇 |
| 外文论文 第二篇 |
（8）丙泊酚抑制脂多糖诱导的非小细胞肺癌恶性转化作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分: HIF1α的表达水平与非小细胞肺癌预后的相关性研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 丙泊酚抑制脂多糖(LPS)诱导的非小细胞肺癌HIF-1α表达上调的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: miR-199a-5p在丙泊酚抑制LPS诱导非小细胞肺癌HIF-1α表达中的作用研究 |
| 1. 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分: 丙泊酚抑制LPS诱导的非小细胞肺癌上皮间质转化(EMT)的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（9）HIF-1α特异性胞内抗体的筛选及肿瘤细胞内转录抑制活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| SAMENVATTING |
| Chapter Ⅰ Introduction |
| 1.1 HIF-1 biology and its role in cancer |
| 1.1.1 Structure and physiological role of HIF- |
| 1.1.2 Regulation of HIF-1 in cells |
| 1.1.3 Signaling pathways of HIF-1 in cells |
| 1.1.4 Role of HIF-1 in cancer progression |
| 1.2 Heavy chain antibodies |
| 1.2.1 Immunoglobulins |
| 1.2.2 Heavy chain antibodies and Nanobodies |
| 1.2.3 Biotechnological advantages of Nanobodies |
| 1.2.4 Potential applications of Nanobodies for diagnosis and cancer therapy |
| 1.3 Targeting HIF-1 in the context of cancer |
| 1.3.1 HIF-1 specific agents in the clinical sectors |
| 1.3.2 Antibody Mediated Immunotherapy |
| 1.4 Nb conjugated particles for therapy and diagnosis |
| 1.4.1 Nb-toxin conjugation |
| 1.4.2 Nbs as targeting modules for drug delivery systems |
| 1.4.3 Intracellular targeting of tumors with Nbs |
| Chapter Ⅱ Aim of the study |
| 2.1 Introduction |
| 2.1.1 Development and characterization of Nanobodies targeting the HIF-1αPAS B domain |
| 2.1.2 Development and characterization of Nanobodies targeting the E.coli SlyD |
| Chapter Ⅲ Selection and characterization of HIF-1αspecific intrabodies |
| 3.2 Introduction |
| 3.3 Materials and methods |
| 3.3.1 Strains,cell lines and plasmids |
| 3.3.2 Synthesis of recombinant HIF-1αdomain protein |
| 3.3.3 Construction of Nanobody libraries |
| 3.3.4 Selection of Nbs |
| 3.3.5 Production of selected Nbs |
| 3.3.6 Thermal stability of Nbs |
| 3.3.7 Affinity analysis by ELISA against rPasB protein |
| 3.3.8 Western Blot with Nbs against rPasB |
| 3.3.9 Stabilization of endogenous HIF-1αprotein in Hela cells |
| 3.3.10 Immunoprecipitation of HIF-1a with Nbs |
| 3.3.11 Flow cytometry of Hela cells with Nbs against HIF-1αprotein |
| 3.3.12 Construction of intrabody expression construct |
| 3.3.13 Cell culture and transfection |
| 3.3.14 Confirmation of presence of intrabodies |
| 3.3.15 Quantitative RT-PCR for HIF-1αinduced target genes |
| 3.4 Results |
| 3.4.1 Generation of Recombinant HIF-1αProteins |
| 3.4.2 Construction of the libraries,panning and screening |
| 3.4.3 Expression and purification of Nbs |
| 3.4.4 Characteristics of Nbs |
| 3.4.5 Specificity of Nbs against antigen |
| 3.4.6 Stabilization of endogenous HIF-1α |
| 3.4.7 Immunoprecipitation of HIF-1αwith Nbs |
| 3.4.8 Flow cytometry analysis with Nbs |
| 3.4.9 Construction of intrabody constructs |
| 3.4.10 Transfection of HeLa cells with intrabody constructs |
| 3.4.11 Detection and functional analysis of intrabodies |
| 3.4.12 Quantitative RT-PCR for HIF-1αinduced target genes |
| 3.5 Discussion |
| 3.6 Conclusion |
| Chapter Ⅳ Generation of Nanobodies against E.coli SlyD for protein purification |
| 4.2 Introduction |
| 4.3 Material and methods |
| 4.3.1 Bacterial strains and culture conditions |
| 4.3.2 Preparation of recombinant antigen |
| 4.3.3 Construction of a Nb library |
| 4.3.4 Display of Nbs on phage particles and biopanning |
| 4.3.5 Screening of specific Nbs by ELISA |
| 4.3.6 Expression and purification of selected Nbs |
| 4.3.7 Antigen specificity of Nbs |
| 4.3.8 Identification of the contaminant protein by LC-MS/MS |
| 4.3.9 Characterization of Nbs |
| 4.3.10 In vivo biotinylation of specific Nb |
| 4.3.11 Strategies to remove contaminant protein from rPasB samples |
| 4.4 Results |
| 4.4.1 PasB gene construction |
| 4.4.2 Construction of immune Nb library,phage display and panning |
| 4.4.3 Screening for antigen-specific Nbs with bacterial extracts in ELISA |
| 4.4.4 Expression and purification of antigen specific Nbs |
| 4.4.5 Target specificity of the Nbs |
| 4.4.6 Identification of contaminant protein by LC-MS/MS |
| 4.4.7 Characteristics of Nbs binding to SlyD |
| 4.4.8 Expression and purification of biotinylated Nb |
| 4.4.9 Removal of bacterial SlyD protein from rPasB sample by immune-complexation with Nb5 |
| 4.5 Discussion |
| 4.6 Conclusion |
| Chapter Ⅴ Discussion and perspectives |
| 5.1 Background |
| 5.2 General discussion and future perspectives |
| 5.2.1 Identification and characterization of HIF-1α-specific Nanobodies for their ability to target HIF-1α |
| 5.2.2 Characterization of SlyD-specific Nanobodies and development of cleaning strategies to eliminate this potential contaminant of recombinant proteins |
| 5.3 General conclusion and perspectives |
| REFERENCE |
| 发表论文和参加科研情况 |
| 论文创新点 |
| APPENDIX:List of abbreviation |
| ACKNOWLEDGEMENTS |
（10）HIF-1α通过调控与血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及食管癌细胞放射敏感性的影响研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 基于基因芯片数据的食管癌血管生成相关基因生物信息学分析 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据处理与统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 食管癌组织中HIF-1α、VEGF和 AGGF1 的表达及其与食管癌放疗疗效的关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 治疗方法 |
| 1.3 检测方法 |
| 1.4 结果判定 |
| 1.5 随访 |
| 1.6 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 2ME2通过抑制HIF-1α表达增加Eca109 细胞放射敏感性的实验研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 缺氧诱导因子-1与肿瘤放射敏感性的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
四、Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α and Its Relationship to Apoptosis and Proliferation in Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma（论文参考文献）
- [1]Cancer metabolism and tumor microenvironment:fostering each other?[J]. Yiyuan Yuan,Huimin Li,Wang Pu,Leilei Chen,Dong Guo,Hongfei Jiang,Bo He,Siyuan Qin,Kui Wang,Na Li,Jingwei Feng,Jing Wen,Shipeng Cheng,Yaguang Zhang,Weiwei Yang,Dan Ye,Zhimin Lu,Canhua Huang,Jun Mei,Hua-Feng Zhang,Ping Gao,Peng Jiang,Shicheng Su,Bing Sun,Shi-Min Zhao. Science China（Life Sciences）, 2022(02)
- [2]p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究[D]. 匡彦蓓. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2021(01)
- [3]靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究[D]. 李雅. 山东大学, 2021
- [4]抑制HIF-1α表达的中药抗肿瘤活性成分研究进展[J]. 史新萌,刘玉萍,瞿鼎,黄琳清,陈彦. 药学学报, 2021(10)
- [5]骨桥蛋白通过PI3K/AKT通路上调HIF-1α表达促进食管癌放疗抵抗[D]. 李晓琳. 山东大学, 2020(04)
- [6]缺氧通过HIF-1α-fascin-1环路促进下咽鳞癌侵袭和转移的机制研究[D]. 步明强. 山东大学, 2020(09)
- [7]缺氧条件下人脐带间充质干细胞（hUCMSCS）对肺腺癌A549细胞增殖的影响及机制研究[D]. 赵成岭. 山东大学, 2019
- [8]丙泊酚抑制脂多糖诱导的非小细胞肺癌恶性转化作用及其机制研究[D]. 杨能力. 苏州大学, 2018(04)
- [9]HIF-1α特异性胞内抗体的筛选及肿瘤细胞内转录抑制活性的研究[D]. 胡耀中. 天津大学, 2017(01)
- [10]HIF-1α通过调控与血管生成相关基因对食管癌组织血管生成及食管癌细胞放射敏感性的影响研究[D]. 陆艳荣. 新疆医科大学, 2017(08)