缺磷诱导拟南芥花青素合成积累的蛋白质组研究

论文摘要

环境因子可以通过调控植物次生代谢产物的合成影响植物品质的形成。花青素（Anthocyandins）属酚类化合物中的类黄酮类,为水溶性色素,是植物重要的次生代谢产物之一。影响花青素合成的主要因素包括光、温度、糖、激素、水分、氮或磷的含量等。磷是植物生长发育必不可少的营养元素。缺磷可以诱导植物花青素积累,然而具体的分子机制还有待于进一步研究。本课题利用同位素相对标记和绝对定量技术（isobaric tags for relative and ab solute quantitation,iTRAQ）研究了拟南芥（Arabidopsis thaliana）在缺磷条件下的蛋白质表达谱,鉴定了缺磷诱导花青素合成积累的关键蛋白;并进一步通过生物信息学和分子生物学手段研究这些蛋白在缺磷诱导拟南芥花青素合成积累中的生物学功能;最后通过拟南芥T-DNA突变体进一步明确这些关键基因（蛋白）的分子生物学功能,初步解析了缺磷诱导拟南芥花青素合成和积累的分子机制,并为进一步理解植物对磷缺乏的分子适应性提供必要的理论基础。主要研究内容及结果如下:1.考查了缺磷处理对野生型拟南芥（Col-0）根长、根相对伸长量、根和地上部分芽中的磷含量以及地上部分芽中花青素含量的影响。结果表明,与正常培养基上生长的幼苗相比,在缺磷培养基上生长7天的拟南芥幼苗的根长显著变短、地上部分芽中磷含量显著降低、花青素含量显著升高,说明用磷缺乏培养基培养拟南芥7天能够成功引起植物磷饥饿反应（Pistarvationresponses,PSRs）特征性的根生长和花青素积累改变。2.采用以iTRAQ为基础的蛋白质组学分析方法比较了磷充足（+Pi）和磷缺乏（-Pi）培养基上生长了 7d的拟南芥幼苗的蛋白质谱。利用LC-MS/MS法结合iTRAQ定量分析差异表达蛋白,并通过生物信息学手段对差异显著蛋白进行初步的功能分析。结果表明,我们一共鉴定到了 156种表达差异显著的蛋白质,初步分析结果表明这些蛋白涉及胁迫反应、防御反应、次级代谢、蛋白质稳态、脂质和氨基酸代谢、碳水化合物代谢、细胞结构、信号转导、转运蛋白和细胞生长/发育等。进一步分析表明,磷缺乏在翻译水平上激活了拟南芥类黄酮生物合成途径,说明磷缺乏可能通过促进类黄酮的生物合成来增加花青素的含量。3.通过对缺磷条件下拟南芥五种PSR基因:非特异性磷脂酶基因（NPC4）（AT3G03530）、两种磺基奎诺糖二酰基甘油基因（SQD1和SQD2）（AT4G33030和AT5G01220）、紫色酸性磷酸酶12基因（PAP12）（AT2G27190）、磷酸盐转运蛋白1;1基因（PHT1;1）（AT5G43350）和一种类黄酮生物合成相关基因二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）（AT5G42800）的转录水平分析,结果显示在缺磷条件下,五个PSR基因相对于对照组显著上调,二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）的转录水平也被显著诱导,这一观察与iTRAQ数据相符合,说明PSR及类黄酮生物合成相关蛋白质（酶）的上调与其转录本丰度的增加一致。4.利用拟南芥T-DNA突变体进一步考查了二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）在花青素合成积累中的功能。测定了缺磷条件下二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）突变体（tt3）和野生型（Ler）拟南芥中二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）的三个上游基因两种苯丙氨酸解氨酶（PAL1和PAL2）（AT2G37040和AT3G53260）和4-香豆酰-CoA连接酶（4CL1）（AT1G51680）及三个下游基因无色花色素双加氧酶（LDOX）（AT4G22880）、花色素5-0-葡糖基转移酶（AA5GT）（AT4G14090）和谷胱甘肽-S-转移酶F12（GSTF12）（AT5G17220）的表达模式,结果显示缺磷显著诱导突变体tt3和野生型Ler拟南芥中二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）三个上游基因表达上调;而二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）三个下游基因在野生型拟南芥中被诱导上调,在tt3突变体中并没有变化。说明缺磷可以成功启动类黄酮生物合成途径,并且磷缺乏可以通过调节花色苷生物合成、修饰和转运来增强花青素的积累。综上所述,本文实验结果表明磷缺乏可能通过促进类黄酮生物合成来增强花青素的积累,二氢黄酮醇4-还原酶基因（DFR）在缺磷诱发拟南芥花青素积累中具有重要作用。研究结果对进一步加深对磷缺乏诱导花青素积累和植物对磷饥饿的适应性响应机制具有一定意义。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要符号说明
• 第一章 文献综述
•   1.1 植物类黄酮合成
•     1.1.1 植物类黄酮及其生物合成途径
•     1.1.2 花青素的生物合成及其调控
•   1.2 植物缺磷胁迫及其耐性机制
•     1.2.1 植物缺磷胁迫
•     1.2.2 植物缺磷耐性机制
•   1.3 蛋白质组学的研究进展
•     1.3.1 蛋白质组学简介
•     1.3.2 蛋白质组学研究策略
•     1.3.3 定量蛋白质组学的研究进展
•     1.3.4 定量蛋白质组学在研究植物响应非生物胁迫中的应用
•   1.4 立题依据与目的意义
•   1.5 论文总体设计思路
• 第二章 缺磷胁迫诱导拟南芥花青素合成和积累
•   2.1 实验材料、试剂与仪器
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 缺磷处理
•     2.2.2 根长测量
•     2.2.3 花青素含量测定
•   2.3 结果与讨论
•     2.3.1 缺磷影响拟南芥根的生长和形态
•     2.3.2 缺磷影响拟南芥地上部分的磷含量
•     2.3.3 缺磷影响拟南芥的花青素含量
•   2.4 本章小结
• 第三章 缺磷胁迫诱导拟南芥花青素合成和积累的蛋白质组分析
•   3.1 实验材料、试剂与仪器
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 试剂
•     3.1.3 仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 缺磷处理
•     3.2.2 总蛋白的提取
•     3.2.3 酶解肽段和iTRAQ标记
•     3.2.4 磷强阳离子交换色谱分析
•     3.2.5 LC-MS/MS质谱分析
•     3.2.6 质谱数据分析
•     3.2.7 iTRAQ定量分析
•     3.2.8 蛋白分类和聚类分析
•   3.3 结果与讨论
•     3.3.1 缺磷胁迫诱导的拟南芥蛋白表达谱
•     3.3.2 拟南芥响应缺磷胁迫的潜在蛋白
•     3.3.3 蛋白聚类分析
•     3.3.4 胁迫和防御相关蛋白
•     3.3.5 代谢相关蛋白
•     3.3.6 蛋白动态平衡相关蛋白
•     3.3.7 细胞结构相关蛋白
•     3.3.8 细胞信号转导蛋白
•   3.4 本章小结
• 第四章 拟南芥缺磷胁迫响应相关蛋白的基因转录水平分析
•   4.1 实验材料、试剂与仪器
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 试剂
•     4.1.3 仪器
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 缺磷处理
•     4.2.2 植物总RNA的提取
•     4.2.3 cDNA第一链合成
•     4.2.4 qPCR分析
•   4.3 结果与讨论
•     4.3.1 磷胁迫响应相关蛋白的基因转录水平分析
•   4.4 本章小结
• 第五章 缺磷诱导拟南芥花青素合成积累依赖于类黄酮合成途径
•   5.1 实验材料、试剂与仪器
•     5.1.1 实验材料
•     5.1.2 试剂
•     5.1.3 仪器
•   5.2 实验方法
•     5.2.1 缺磷处理
•     5.2.2 植物总RNA的提取
•     5.2.3 cDNA第一链合成
•     5.2.4 qPCR分析
•   5.3 结果与讨论
•     5.3.1 类黄酮合成途径早期基因表达分析
•     5.3.2 类黄酮合成途径下游基因表达分析
•     5.3.3 缺磷诱导的拟南芥花青素合成和积累依赖于植物类黄酮合成途径
•   5.4 本章小结
• 第6章 结论与展望
•   6.1 结论
•   6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 硕士期间发表的论文及参与的科研项目

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 周锈连

导师: 徐茂军,王占旗

关键词: 拟南芥,缺磷,定量蛋白质组学,花青素生物合成

来源: 杭州师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 杭州师范大学

分类号: Q943.2

总页数: 91

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